Шпаргалка: Методы исследования в цитологии. Методы изучения клетки Методы цитологии биология

1) Что такое цитология? Предмет и задачи цитологии. Какова роль цитологии в системе биологических знаний и для современной медицины? Роль отечественных ученых в развитии современной цитологии.

Цитология (греч. kytos - ячейка, клетка) - наука о клетке.

Предметом ее изучения является клетка как структурная и функциональная единица жизни. В задачи цитологии входит изучение строения и функционирования клеток, их химического состава, функций отдельных клеточных компонентов, познание процессов воспроизведения

клеток, приспособления к условиям окружающей среды, исследование особенностей строения специализированных клеток, этапов становления их особых функций, развития специфических клеточных структур и др. Для решения этих задач в цитологии используются различные методы.

Р. Вирхов также внес большой вклад, развив и дополнив клеточную теорию; он написал труд «Целлюлярная патология»

Первая кафедра гистологии была открыта в Московском университете в 1864 году профессором Овсянниковым. В это же время кафедра открылась в Военно-медицинской академии, возглавил ее Лавдовский. Только через 13 лет в Росси появился первый учебник Овсянникова и Лавдовского. Москоскую кафедру гистологии возглавил А.И. Бабухин.

П р ед с т а в и т ел и эт и х т р ех ш к ол в с в о и х и с с л ед о в а н и я х п р о в од и л и ч ет к у ю гистофизиологическую позицию, т.е. не только описывали строение, но пытались объяснить

закономерность строения, поэтому физиологическая направленность является приоритетной для отечественной гистологии.

Казанская школа морфологов известна своими трудами в области изучения нервной ткани, в том числе в.н.с. Арнштейн, Смирнов и Догель стали основателями этого направления. Поэтому в России многие вопросы о структуре органов и тканей стали рассматриваться с позиции нервной регуляции. Этому также способствовали работы Боткина, Павлова и Сеченова.

В начале 20 века в гистологии наиболее усиленно стали развиваться эволюционные подходы, основывавшиеся на работах Дарвина и Геккеля. Благодаря работам эмбриологов Вольфа, Пандера и Бэра, в дальнейшем трудам Мечникова и Ковалевского, были продолжены искания в области эмбриологии и поддержаны эволюционные подходы.

Направленность советской гистологической школы была четкой в отношении клиники, поэтому большая часть гистологических работ была направлена на решение клинических задач.

2) Методы исследования в цитологии. Методы изготовления препаратов для световой микроскопии. Значение и методы окраски микропрепаратов. Техника микроскопирования.

Основным методом изучения клеток является световая микроскопия. Человеческий глаз обладает разрешающей способнос-тьюоколо 100мкм(1 мкм = 0,001 мм). Это означает, что две точки, расположенн ые на расстоянии менее чем 100 мкм друг от друга, кажутся одной расплывчатой точкой. Чтобы различить более мелкие структуры, применяют оптические приборы, в частности микроскопы. Разрешающая способность микроскопов составляет 0,13- 0,20 мкм, т. е. примерно в тысячу раз превышает разрешающую способность человеческого глаза. С помощью световых микроскопов, в которых используется солнечный или искусственный свет, удается выявить многие детали внутреннего строения клетки - отдельные

органеллы, клеточную оболочку. Создать световой микроскоп с большим разрешением невозможно, потому что разрешающая способность связана с длиной волны световых лучей, а не только с качеством увеличительных стекол.

Для изучения ультратонкого строения клеточных структур прибегают к методу электронной микроскопии. В электронных микроскопах вместо световых лучей используется пучок электронов. Разрешающая способность современных электронных микроскопов составляет 0,1 нм, поэтому с их помощью выявляют очень мелкие детали. В электронном микроскопе видны

биологические мембраны (толщина 6-10 нм), рибосомы (диаметр около 20 нм), микротрубочки (толщина около 25 нм) и другие структуры.

Для исследования химического состава, выяснения локализации отдельных химических веществ в клетке широко используются методы цито- и гистохимии, основанные на избирательном воздействии реактивов и красителей на определенные химические вещества цитоплазмы. Метод дифференциального (разделительного) центрифугирования позволяет разделить с помощью центрифуги содержимое клетки на отдельные разные по массе составляющие и затем детально изучить их химический состав. Метод рентгеноструктурного анализа дает возможность определять пространственное расположение и физические свойства молекул (например, ДНК, белков), входящих в состав клеточных структур.

Для выявления локализации мест синтеза биополимеров, определения путей переноса веществ в клетке широко используется метод авторадиографии - регистрации веществ, меченых радиоактивными изотопами. Многие процессы жизнедеятельности клеток, в частности деление клетки, фиксируют с помощью кино-и фотосъемки.

Изучение клеток разных органов и тканей растений и животных, процессов деления клетки, их дифференцировки и специализации проводят методом клеточных культур - выращиванием клеток (и целых организмов из отдельных клеток) на питательных средах в стерильных условиях.

При исследовании живых клеток, выяснении функций отдельных органелл применяют методы микрохирургии - оперативного воздействия на клетку, связанного с удалением или имплантированием отдельных органелл, их пересаживанием из клетки в клетку, введением в

клетку крупных макромолекул и т. д.

Витальный способ окраски Для витального (прижизненного) крашения применяют 0,2-0,001 % водные растворы

метиленового и толуоидинового синего, нейтральрот и конго красный, которые добавляют в придавленную или висячую капли культуры. Этим способом выявляют спирохеты, простейшие, определяют подвижность бактерий, иммунное набухание капсулы, но использование его требует строгого соблюдения правил, исключающих лабораторное заражение.

Поствитальные способы окраски Способы окраски фиксированных препаратов (поствитальные) разделяют на простые и

сложные. При простых способах красящие растворы фуксина Пфейффера (экспозиция 1-2 мин), щелочного метиленового синего (3-5 мин) наносят на фиксированный препарат, так, чтобы он полностью покрыл мазок, краситель сливают, препарат промывают струйкой воды, встряхивают, высушивают и микроскопируют.

Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации, взаимном расположении отдельных клеток, но с их помощью нельзя установить структуру микробов и часто их дифференцированное отношение к красителям.

Из сложных способов окрашивания бактерий в основном используют дифференцированный способ Грама, выявление кислотоустойчивости по Цилю - Нельсону, определение волютиновых зёрен по Леффлеру или Нейссеру, дифференцирующий способ Романовского - Гимзы, негативно-позитивный способ определения капсулы по Гинсу - Бурри, выявление спор по Пешкову или Цилю - Нельсону и др.

Для окраски простейших применяют способ Романовского - Гимзы и окраску гематоксилин- эозином.

Грибы исследуют неокрашенными или способами Грама, Циля - Нельсона, Леффлера, Романовского - Гимзы, а также раствором Люголя, лактофуксином и др.

Техника микроскопирования. Прежде чем начать микроскопирование, необходимо установить правильное освещение. Для этого с микроскопа снимают окуляр и, глядя прямо в объектив, устанавливают зеркало так, чтобы источник света (лампа или окно) были видны посредине объектива. После предварительной установки света на предметный столик микроскопа кладут готовый препарат и закрепляют его зажимами. При помощи макрометрического винта опускают тубус почти до соприкосновения с покровным стеклом. Затем, глядя в окуляр, постепенно поднимают тубус до появления изображения. Для наведения резкости пользуются

микрометрическим винтом.

При микроскопиравании следует держать оба глаза открытыми. Смотрят в микроскоп левым глазом.

3) Строение и функции ядра клеток по данным световой и электронной микроскопии. Форма и количество ядер. Основные компоненты ядра. Взаимодействие структур клетки в процессе метаболизма (на примере образования эмали и дентина зуба).

Ядро имеется в клетках всех эукариот за исключением эритроцитов млекопитающих. У некоторых простейших имеются два ядра, но как правило, клетка содержит только одно ядро. Ядро отграничено от цитоплазмы ядерной оболочкой, которая состоит из двух мембран: наружной и внутренней, имеющих такое же строение, как и плазматическая мембрана. Между ними находится узкое пространство, заполненное полужидким веществом. Через множество пор в ядерной оболочке осуществляется обмен веществ между ядром и цитоплазмой (в частности, выход и-РНК в цитоплазму). Внешняя мембрана часто бывает усеяна рибосомами, синтезирующими белок.

Под ядерной оболочкой находится кариоплазма (ядерный сок), в которую поступают вещества из цитоплазмы. Кариоплазма содержит хроматин – вещество, несущее ДНК, и ядрышки. Ядрышко – это округлая структура внутри ядра, в которой происходит формирование рибосом. Совокупность хромосом, содержащихся в хроматине, называют хромосомным набором. Число хромосом в соматических клетках диплоидное (2n), в отличие от половых клеток, имеющих гаплоидный набор хромосом (n).

Важнейшей функцией ядра является сохранение генетической информации. При делении

клетки ядро также делится надвое, а находящаяся в нём ДНК копируется (реплицируется). Благодаря этому у всех дочерних клеток также имеются ядра.

Из паренхиматозных клеток пульпы на протяжении всей жизни человека формируются новые одонтобласты. Процесс дифференцировки происходит под контролем регуляторных белков. Метаболизм дентина, т.е. построения матрицы, минерализация, ремоделирование, имеет много общего с костной тканью, но эти процессы протекают более медленно. Дентин отличается от костной ткани количественным и качественным белковым составом, а также содержанием минерального компонента. Активность протекания некоторых метаболических процессов также различна.

В обмене органических веществ участвуют одонтобласты, лежащие на границе дентина и пульпы. При повреждении дентина эти клетки способны восстанавливать матрицу и регулировать ее минерализацию. В стоматологии применяют препараты, стимулирующие этот процесс.

В процессе формирования матрицы и ее минерализации (созревание эмали) происходят изменение органического состава ткани и апоптоз амелобластов. Зрелая эмаль – бесклеточная минерализованная ткань и поэтому неспособная к регенерации при повреждениях.

В состав органической составляющей зрелой эмали входят несколько ферментов: сериновые протеазы, металлопротеазы (коллагеназы), фосфатазы, которые участвовали в деградации белков на стадии минерализации и частично сохранились в матриксе. Кроме того, присутствуют свободные аминокислоты (глицин, валин, пролин, гидрок-сипролин), следы гликозилированных, сульфа-тированных, фосфорилированных белков, аналогичных неколлагеновым белкам костной ткани. Анализ углеводсодержащих структур гликопротеинов показал присутствие галактозы, глюкозы, маннозы, глюкуроновой кислоты и следы других моносахаридов. В очень небольших количествах в эмали содержатся цитрат и липиды. Органические вещества находятся между кристаллами апатита в виде пучков, пластинок или веретен, они влияют на биохимические и физические процессы, происходящие в эмали зуба.

4) Органеллы. Определение, классификация, строение и функции. Органоиды общего значения. Органоиды специального значения. Строение и функции по данным световой и электронной микроскопии

Органеллы делятся на две группы: мембранные и немембранные. Мембранные органеллы представлены двумя вариантами: двумембранным и одномембранным.

Двумембранными компонентами являются пластиды, митохондрии и клеточное ядро.

К одномембранным относятся органеллы вакуолярной системы - эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, лизосомы, вакуоли растительных и грибных клеток, пульсирующие вакуоли и др.

К немембранным орга-неллам принадлежат рибосомы и клеточный центр, постоянно присутствующие в клетке.

5) Включения. Определение, классификация, роль в жизнедеятельности.клетки.

Включения цитоплазмы - это необязательные компоненты клетки, появляющиеся и исчезающие в зависимости от интенсивности и характера обмена веществ в клетке и от условий существования организма. Включения имеют вид зерен, глыбок, капель, вакуолей, гранул различной величины и формы. Их химическая природа очень разнообразна. В зависимости от функционального назначения включения объединяют в группы:

трофические;

секреты ;

инкреты ;

пигменты ;

экскреты и др.

специальные включения (гемоглобин)

Среди трофических включений (запасных питательных веществ) важную роль играют жиры и углеводы. Белки как трофические включения используются лишь в редких случаях (в

яйцеклетках в виде желточных зерен).

Пигментные включения придают клеткам и тканям определенную окраску.

Секреты и инкреты накапливаются в железистых клетках, так как являются специфическими продуктами их функциональной активности.

Экскреты - конечные продукты жизнедеятельности клетки, подлежащие удалению из нее.

6. Особенности строения и функций клеточной оболочки по данным световой и электронной микроскопии. Производные клеточной оболочки. Межклеточные соединения и их структурно-функциональная характеристика.

барьер, защищающий клетки, её мы и называем – клеточной мембраной. Она не позволяет компонентам клетки (цитоплазме) вытечь наружу. Главная задача клеточной мембраны - это удерживать клетку в целостности, при этом определять, что может попасть внутрь клетки, а что может оттуда выйти. Клетки любого организма имеют клеточные мембраны, даже клетки бактерий.

Состоит клеточная мембрана из бинарного ряда липидов. Располагаются молекулы липидов в два ряда и каждый ряд точно такой же, как предыдущий. Структуру молекулы липида - эти две части единого целого, как раз и отображают. Ещё эти две части единого целого называют – гидрофобной (водонепроницаемой) и гидрофильной секциями.

Гидрофобная секция не любит воду и подобных воде молекул, благодаря бинарному слою липидов выступает вроде защитного механизма.

Гидрофильная секция напротив способна притягивать воду и подобные воде молекулы, после чего выталкивает их наружу. В итоге получается такая базовая жидкая мозаичная модель.

производные оболочки: цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид;

временными - капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий, у некоторых видов они отсутствуют полностью.

Межклеточные контакты - соединения между клетками, образованные при помощи белков. Межклеточные контакты обеспечивают непосредственную связь между клетками. Кроме того, клетки взаимодействуют друг с другом на расстоянии с помощью сигналов (главным образом -

сигнальных веществ), передаваемых через межклеточное вещество.

Строение межклеточных соединений В тех тканях, в которых клетки или их отростки плотно прилежат друг к другу (эпителий,

мышечная ткань и пр.) между мембранами контактирующих клеток формируются связи – межклеточные контакты. Каждый тип межклеточных контактов формируется за счет специфических белков, подавляющее большинство которых - трансмембранные белки. Специальные адапторные белки могут соединять белки межклеточных контактов с цитоскелетом, а специальные «скелетные» белки - соединять отдельные молекулы этих белков в сложную надмолекулярную структуру. Во многих случаях межклеточные соединения разрушаются при удалении из среды ионов Ca2+.

Функции межклеточных соединений Межклеточные соединения возникают в местах соприкосновения клеток в тканях и служат для

межклеточного транспорта веществ и передачи сигналов (межклеточное взаимодействие), а также для механического скрепления клеток друг с другом.

Через щелевые контакты могут передаваться электрические сигналы. Клетки органов и тканей вырабатывают ряд химических веществ, действующих на другие клетки (в том числе через межклеточные контакты) и вызывающих изменения в работе цитоскелета, в интенсивности обмена веществ и процессе синтеза клеткой белков.

7) Митотический цикл. Характеристика всех фаз митоза. Мейоз, его особенности, отличия от митоза. Регенерация и реактивность клеток и их проявления в органах ротовой полости.

Митотический цикл - это жизнедеятельность клетки от деления до следующего деления. Митотический цикл в малодифференцированных клеточных популяциях занимает около суток. Жизненный цикл может быть равен митотическому, но в отличие от него - это более широкое понятие и охватывает постмитотические популяции клеток, потерявших способность к делению с высокой степенью дифференциации.

Если клетка делится и митотический с клеточным циклом равны, то цикл означает многократное повторение некоторой последовательности событий, причем конечное завершается к началу первого следующей последовательности. Митотический цикл заканчивается телофазой с делением клетки, а новый начинается при образовании двух новых клеток. Митотический цикл состоит из митоза и интерфазы. В интерфазе различают последовательные фазы G1, S и G2.

G1-фаза (пресинтетический период) - обычно самая продолжительная и следует за телофазой митоза. Она длится от 10 ч до нескольких суток: у быстро делящихся клеток она более короткая. Во время G1-фазы происходит подготовка к удвоению хромосом, клетка интенсивно синтезирует РНК и белки, растет, увеличивается количество рибосом, митохондрий. Клетка восстанавливает размеры предшественницы. Достигнув определенных размеров, клетка вступает в следующую фазу (синтетический период), но это происходит не всегда. Часть клеток продолжает накапливать структурные элементы и не делится. Тогда G1-фаза затягивается, и клетки могут прекратить делиться, переходя в так называемую G0-фазу.

Клетки могут находиться в G0-фазе длительное время, начинают расти, дифференцироваться, достигая состояния терминальной (окончательной) дифференцировки. Такая клетка обычно теряет способность к делению и в этом случае окончание клеточного периода сопровождается гибелью клетки.

В S-фазу интерфазы (синтетический период) в клетке продолжается синтез белка, но этот процесс не главный. Ведущим процессом является репликация (удвоение) ДНК, которая одновременно идет во многих точках ДНК (репликонах). Начинается также удвоение

центриолей в клеточном центре. В большинстве клеток синтетический период длится 8…12 ч. К окончанию синтетического периода в клетке имеется тетраплоидный набор ДНК и удвоенный набор центриолей.

В G2-фазу интерфазы (постсинтетический период) синтез РНК снижается, продолжается остаточный синтез белка и накапливается энергия для митоза. В этот период синтезируются белки, необходимые для нормального деления клетки, в том числе тубулины - белки микротрубочек. В клетке тетраплоидный набор ДНК. Дочерние центриоли увеличиваются в

размерах и достигают размеров зрелых органелл. Эта фаза длится 2…4 ч.

Принципиальное отличие митоза от мейоза состоит в следующем:

1) в митозе каждый цикл деления ядра связан с одной репродукцией хромосом, в мейозе два деления связаны с одной репродукцией;

2) в митозе каждая хромосома репродуцируется, и в анафазе дочерние хромосомы расходятся к полюсам. При этом гомологичные хромосомы ведут себя независимо. В результате деления каждая дочерняя клетка получает полный набор хромосом с одинаковым содержанием генов. В мейозе в профазе каждая пара гомологичных хромосом конъюгирует, и в дочерних ядрах происходит уменьшение числа хромосом ровно вдвое, соответствующее числу бивалентов. При этом каждая пара гомологов расходится независимо от других пар. В тех случаях, когда по различным причинам утрачивается один из гомологов гомологичных хромосом, одиночные хромосомы, не имеющие гомолога (униваленты), расходятся случайно и попадают лишь в одно из дочерних ядер;

3) в силу отсутствия конъюгации хромосом в митозе и наличия ее в мейозе в последнем имеет место продолжительная и сложно протекающая профаза.

Мейоз с его стадиями и фазами развития половых клеток является лишь одним из этапов процесса полового размножения; после мейоза наступает этап формирования зрелых половых клеток - гамет. Процесс образования зрелых половых клеток называют гаметогенезом.

8). Клетка как основная единица живого. Клеточный цикл (дать характеристику этапам клеточного цикла). Основные положения клеточной теории и ее значении для медицины

Клетка представляет собой наименьшую структурно-функциональную единицу живых организмов, способную к самообновлению, саморегуляции и самовоспроизведению.

Клетка - это специализированная система биополимеров, ограниченная клеточной мембраной, обладающей избирательной проницаемостью.

Клетка - это та наименьшая структура, которая обладает всеми основными свойствами живого. Ее части и органеллы не способны по отдельности выполнять все функции и, таким образом, не могут рассматриваться как отдельные (автономные) живые единицы.

Клеточный цикл эукариот состоит из двух периодов:

Период клеточного роста, называемый «интерфаза», во время которого идет синтез ДНК

и белков и осуществляется подготовка к делению клетки.

Периода клеточного деления, называемый «фаза М» (от слова mitosis - митоз ). Интерфаза состоит из нескольких периодов:

G1-фазы (от англ. gap - промежуток), или фазы начального роста, во время которой идет синтез мРНК, белков, других клеточных компонентов;

S-фазы (от англ. synthesis - синтез), во время которой идет репликация ДНК клеточного ядра, также происходит удвоение центриолей (если они, конечно, есть).

G2-фазы, во время которой идет подготовка к митозу.

У дифференцировавшихся клеток, которые более не делятся, в клеточном цикле может отсутствовать G1 фаза. Такие клетки находятся в фазе покоя G0.

Период клеточного деления (фаза М) включает две стадии:

кариокинез (деление клеточного ядра);

цитокинез (деление цитоплазмы).

В свою очередь, митоз делится на пять стадий.

Описание клеточного деления базируется на данных световой микроскопии в сочетании с микрокиносъемкой и на результатах световой и электронной микроскопии фиксированных и окрашенных клеток.

Положения клеточной теории Шлейдена-Шванна

1 Все животные и растения состоят из клеток.

2 Растут и развиваются растения и животные путём возникновения новых клеток. 3 Клетка является самой маленькой единицей живого, а целый организм - это

совокупность клеток.

Основные положения современной клеточной теории 1 Клетка - это элементарная, функциональная единица строения всего живого. (Кроме

вирусов, которые не имеют клеточного строения)

2 Клетка - единая система, она включает множество закономерно связанных между собой элементов, представляющих целостное образование, состоящее из сопряжённых функциональных единиц - органоидов.

3 Клетки всех организмов гомологичны.

4 Клетка происходит только путём деления материнской клетки.

5 Многоклеточный организм представляет собой сложную систему из множества клеток, объединённых и интегрированных в системы тканей и органов, связанных друг с другом.

6 Клетки многоклеточных организмов тотипотентны.

7 Клетка может возникнуть лишь из предшествующей клетки.

Эти положения доказывают единство происхождения всех живых организмов, единство всего органического мира. Благодаря клеточной теории стало понятно, что клетка - это важнейшая составляющая часть всех живых организмов.

Клетка - самая мелкая единица организма, граница его делимости, наделенная жизнью и всеми основными признаками организма. Как элементарная живая система, она лежит в основе строения и развития всех живых организмов. На уровне клетки проявляются такие свойства

жизни, как способность к обмену веществ и энергии, авторегуляция, размножение, рост и развитие, раздражимость.

9. Цитоплазма. Общая морфофункциональная характеристика. Гиалоплазма, ее физико-химическая характеристика и значение в жизнедеятельности клетки.

Цитопла́зма (от греч. κύτος «клетка» и πλάσµα здесь «содержимое») - внутренняя среда живой или умершей клетки, кроме ядра и вакуоли, ограниченная плазматической мембраной. Включает гиалоплазму - основное прозрачное вещество цитоплазмы, находящиеся в ней обязательные клеточные компоненты - органеллы, а также различные непостоянные структуры - включения. Иногда под цитоплазмой понимают только гиалоплазму.

Термин «цитоплазма» ввёл Эдуард Страсбургер в 1882 году.

В состав цитоплазмы входят органические и неорганические вещества многих видов. Основное вещество цитоплазмы - вода. Многие вещества (например, минеральные соли, глюкоза, аминокислоты) образуют истинный раствор, некоторые другие (например, белки) - коллоидный. В ней протекают почти все процессы клеточного метаболизма. Среди прочего, в цитоплазме есть нерастворимые отходы обменных процессов и запасные питательные вещества.

Цитоплазма постоянно движется, перетекает внутри живой клетки, перемещая вместе с собой различные вещества, включения и органоиды. Это движение называется циклозом. Цитоплазма способна к росту и воспроизведению и при частичном удалении может восстановиться. Однако она нормально функционирует только в присутствии ядра. Без него долго существовать цитоплазма обычно не может, как и ядро без цитоплазмы.

Важнейшая роль цитоплазмы - объединение всех клеточных структур (компонентов) и обеспечение их химического взаимодействия. Она выполняет и другие функции, в частности, поддерживает тургор клетки.

Внутри клетки находится цитоплазма. Она состоит из жидкой части - гиалоплазмы (матрикса), органелл и цитоплазматических включений.

Гиалоплазма

Гиалоплазма - основное вещество цитоплазмы, заполняет все пространство между плазматической мембраной, оболочкой ядра и другими внутриклеточными структурами. Гиалоплазму можно рассматривать как сложную коллоидную систему, способную существовать

в двух состояниях: золеобразном (жидком) и гелеобразном, которые взаимно переходят одно в

другое. В процессе этих переходов осуществляется определенная работа, затрачивается энергия. Гиалоплазма лишена какой-либо определенной организации. Химический состав гиалоплазмы: вода (90%), белки (ферменты гликолиза, обмена сахаров, азотистых оснований, белков и липи-дов). Некоторые белки цитоплазмы образуют субъединицы, дающие начало таким органеллам, как центриоли, микрофиламенты.

Функции гиалоплазмы:

1) образование истинной внутренней среды клетки, которая объединяет все органеллы и обеспечивает их взаимодействие;

2) поддержание определенной структуры и формы клетки, создание опоры для внутреннего расположения органелл;

3) обеспечение внутриклеточного перемещения веществ и структур;

4) обеспечение адекватного обмена веществ как внутри самой клетки, так и с внешней средой.

Включения

Это относительно непостоянные компоненты цитоплазмы. Среди них выделяют:

1) запасные питательные вещества, которые используются самой клеткой в периоды недостаточного поступления питательных веществ извне (при клеточном голоде), - капли жира, гранулы крахмала или гликогена;

2) продукты, которые подлежат выделению из клетки, например, гранулы зрелого секрета в секреторных клетках (молоко в лактоцитах молочных желез);

3) балластные вещества некоторых клеток, которые не выполняют какой-либо конкретной функции (некоторые пигменты, например, липофусцин стареющих клеток).

10. Эмбриологиякак наука о развитии зародыша. Этапы эмбрионального развития, критические периоды в развитии зародыша.

Эмбриология – это наука о развитии и строении зародыша человека.

Задачами медицинской эмбриологии являются изучение: прогенеза, этапов эмбриогенеза (от оплодотворения и до момента рождения), механизмов эмбриогенеза, нарушений эмбрионального развития, возникновение причин нарушения развития, изучение критических периодов, разработка мер профилактики и изучение постнатального развития (т.е. развития после рождения) до периода полного становления всех органов и систем организма.

В развитии выделяют: историческое развитие организма (филогенез) и индивидуальное развитие организма (онтогенез). В онтогенезе выделяют эмбриогенез и постнатальное развитие.

Наиболее ранним методом изучения эмбриологии является описательный метод, затем сравнительный и экспериментальный (это, прежде всего, искусственное оплодотворение) методы.

В эмбриогенезе выделяют периоды:

Оплодотворение;

Дробление;

Гаструляция;

Гистогенез;

Органогенез;

Системогенез;

- формирование организма в целом.

В процессе эмбриогенеза выделяют критические периоды, когда минимальные по силе факторы могут вызвать максимальное изменения в развитии. К таким периодам относятся:

- прогенез (образование половых клеток);

- процесс оплодотворения;

Дробление;

Гаструляция;

Имплантация (7-8 сутки);

Гистогенез;

Органогенез;

Системогенез;

Плацентарный (3-8 неделя);

- процесс рождения ребенка, включающий смену среды от водной к воздушной.

11. Особенности ранних стадий развития человека. Что такое зигота и как она образуется? Типы дробления у позвоночных животных и человека.

Зиго́та (от др.-греч. ζυγωτός - спаренный, удвоенный) - диплоидная (содержащая полный двойной набор хромосом) клетка, образующаяся в результате оплодотворения (слияния яйцеклетки и сперматозоида). Зигота является тотипотентной (то есть, способной породить любую другую) клеткой. Термин ввёл немецкий ботаник Э. Страсбургер.

У человека первое митотическое деление зиготы происходит спустя приблизительно 30 часов после оплодотворения, что обусловлено сложными процессами подготовки к первому делению дробления. Клетки, образовавшиеся в результате дробления зиготы называют бластомерами. Первые деления зиготы называют «делениями дробления» потому, что клетка именно дробится: дочерние клетки после каждого деления становятся всё мельче, а между делениями отсутствует стадия клеточного роста.

Выделяют 2 основных типа дробления: Голобластическое – в процесс дробления вовлекается вся цитоплазма яйцеклетки; Меробластическое – не вся цитоплазма вовлекается. Голобластическому дробления подвергаются олиго- и алицитальные яйца. Голобластическое дробление делят на: радиальное и спиральное. Радиальное характерно для иглокожих, ланцетника и млеков. Спиральное идет как бы по спирали и бластомеры совершают поворот с

плотным складыванием. Это наблюдается у червей, моллюсков. Поверхностное дробление характерно для насекомых с центролицетальным яйцом. Меробластическое дискоидальное, когда дроблению подвергаются только зародышевый диск, расположенный на желтке. У головоногих моллюсков меробластическое билатеральное. Дискоидальное дробление у рыб, рептилий и птиц. У млеков радиальное дробление называют ротационным (круговое) синхронным. После 1-го дробления один делится в радиальной, а другой в экваториальной. Это асинхронное дробление: начиная после стадии 2-х бластомеров один бластомер делится, а второй не делится. У млеков бластомеры расположены рыхло относительно друг друга и процесс завершается компактизацией. Дробление у моллюска: 1) сначала в медиальной плоскости; 2) после 4-го дробления идет не равномерное: нижний ярус делится на 2 неравные клетки (крупные макро - и мелкие микромеры, а над ними мезомеры). С этого дробления закладываются зародышевые листки. У Лягушки первая борозда дробления еще не доходит до вегетативного полюса, а уже формируется 2-я борозда. У анимального полюса образуется небольшая полость – бластоцель. У лягушки имеется серый серп. Наружный слой цитоплазмы более плотный, содержащий гранулы. Когда сперматозоид проникает, то он за собой вовлекает гранулы. Тогда цитоплазма совершает поворот на 30 град. – образуется серый серп. Спиральное дробление: бластомеры могут быть одинакового размера, либо разными. Каждый бластомер на 4-й стадии контактирует друг с другом. Полости внутри не образуется, либо образуется небольшая. Меробластическое билатеральное дробление: правая и передняя сторона симметрична, а верхняя и нижняя разные. У дрозофилы идет процесс с 9-ю этапами. Ядро дробится и ядра по мостикам отходят к периферии. Там каждый бластомер делится 4 раза. Между ними образуется плазматическая мембрана с образованием бластодермы. На стадии 512 бластомеров образуются полярные половые клетки.

13. Гисто- и органогенез на 2-3 неделе развития. Мезенхима, образование, строение и роль в развитии тканей.

На 2 – 3-й неделе, т. е. в процессе второй фазы гаструляции и сразу же после нее, происходит закладка зачатков осевых органов:

1) хорды;

2) нервной трубки;

3) кишечной трубки.

В период между I и II фазами гаструляции, т. е. с 9-х по 14-е сутки формируются внезародышевая мезенхима и три внезародышевых органа – хорион, амнион, желточный мешок

Развитие, строение и функции хориона. В процессе имплантации бластоцисты ее трофобласт по мере внедрения из однослойного становится двухслойным и состоит из цитотрофобласта и симпатотрофобласта. Симпатотрофобласт представляет собой структуру, в которой в единой цитоплазме содержится большое число ядер и клеточных органелл. Образуется он посредствам слияния клеток, выталкиваемых из цитотрофобласта. Таким образом, эмбриобласт, в котором происходит I фаза гаструляции, окружен внезародышевой оболочкой, состоящей из цито– и симпластотрофобласта.

В процессе имплантации из эмбриобласта выселяются в полость бластоцисты клетки, образующие внезародышевую мезенхиму, которая подрастает изнутри к цитотрофобласту.

После этого трофобласт становится трехслойным – состоит из симпластотрофобласта, цитотрофобласта и париентального листка внезародышевой мезенхимы и носит название хориона (или ворсинчатой оболочки). По всей поверхности хориона располагаются ворсины, которые вначале состоят из цито– и симпластотрофобласта и называются первичными. Затем в них врастает изнутри внезародышевая мезенхима, и они становятся вторичными. Однако постепенно на большей части хориона ворсинки редуцируются и сохраняются только в той части хориона, которая направлена к базальному слою эндометрия. При этом ворсинки

разрастаются, в них врастают сосуды, и они становятся третич-ными.

При развитии хориона выделяют два периода:

1) формирование гладкого хориона;

2) формирование ворсинчатого хориона.

Из ворсинчатого хориона в последующем формируется плацента.

Функции хориона:

1) защитная;

2) трофическая, газообменная, экскреторная и другие, в которых хорин принимает участие, будучи составной частью плаценты и которые выполняет плацента.

Развитие, строение и функции амниона. Внезародышевая мезенхима, заполняя полость бластоцисты, оставляет свободными небольшие участки бластоцели, прилежащие к эпибласту и гипобласту. Эти участки составляют мезенхимальные закладки амниотического пузырька и желточного мешка.

Стенка амниона состоит из:

1) внезародышевой эктодермы;

2) внезародышевой мезенхимы (висцерального листка).

Функции амниона – образование околоплодных вод и защитная функция.

Развитие, строение и функции желточного мешка. Из гипобласта выселяются клетки, составляющие внезародышевую (или желточную) энтодерму, и, обрастая изнутри мезенхимальную закладку желточного мешка, образуют вместе с ней стенку желточного мешка. Стенка желточного мешка состоит из:

1) внезародышевой (желточной) энтодермы;

2) внезародышевой мезенхимы.

Для прогресса гистологии, цитологии и эмбриологии большое значе­ние имеет внедрение достижений физики и химии, новых методов смеж­ных наук - биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии.

Современные методы исследования позволяют изучать ткани не только как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для изуче­ния их жизнедеятельности в течение длительного времени, выделять отдель­ные клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы (например, ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Такие возможности открылись в связи с созданием новых приборов и технологий - различных типов микроскопов, компьютерной техники, рен-тгеноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резо­нанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получе­ния гибридов; использования биотехнологических методов - получения гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.

Таким образом, биологические объекты можно изучать на тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Несмотря на внедрение в естественные науки разнообразных биохимических, биофизических, фи­зических и технологических методов, необходимых для решения многих вопросов, связанных с жизнедеятельностью клеток и тканей, гистология в основе своей остается морфологической наукой со своим набором методов. Последние позволяют охарактеризовать процессы, происходящие в клетках и тканях, их структурные особенности.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа явля­ются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микро­скопе, применение методов микроскопирования, качественный и количе­ственный анализ изображений.

Объектами исследования служат живые и фиксированные клет­ки и ткани, их изображения, полученные в световых и электронных мик­роскопах или на телевизионном экране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных объектов.

Методы микроскопирования гистологических препаратов

Основными методами изучения биологических микрообъектов являют­ся световая и электронная микроскопия, которые широко используют"ся в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - основной метод изучения микрообъектов, ис­пользуемый в биологии более 300 лет. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные оптические си­стемы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d o ), которое в основном зависит от длины волны света (\) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется фор­мулой d 0 = 1 / 2 \. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате. Для изучения гистологических препаратов при­меняют разнообразные виды световых микроскопов и электронные мик­роскопы.

Рис. 1. Микроскопы для биологичес­ких исследований.

А - световой биологический микроскоп «Биолам-С»: 1 - основание; 2 - тубусо-держатель; 3 - наклонный тубус; 4 - оку­ляр, 5 - револьвер; 6 - объективы; 7 - столик; 8 - конденсор с ирисовой диаф­рагмой; 9 - винт конденсора; 10 - зерка­ло; 11 - микрометрический винт; 12 - макрометрический винт. Б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизиро­ванной системой обработки изображений: 1 - колонка микроскопа (с электронно-оптической системой и камерой для образ­цов); 2 - пульт управления; 3 - камера с люминесцентным экраном; 4 - блок ана­лиза изображений; 5 - датчик видеосигна­ла.

Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В обычных све­товых микроскопах источником освещения служит естественный или ис­кусственный свет (рис. 1, А). Минимальная длина волны видимой части спектра равна примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние равно приблизительно 0,2 мкм (d o = "/,- 0,4 мкм = 0,2 мкм), а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500-2500.

Таким образом, в световом микроскопе можно видеть не только отдель­ные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структу­ры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия . Это разновидность световой микроско­пии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафи­олетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет при­близительно 0,1 мкм (d o = V 2 - 0,2 мкм = 0,1 мкм). Полученное в ультрафи­олетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специаль­ных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобра­зователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресцен­ции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный пе­реход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испускани­ем света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксеноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие вы­сокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолето­вые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэто­му их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первич­ную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехолами-ны (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (ме­тод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связы­ваются с определенными макромолекулами (акридин оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов чаще всего упот­ребляется флюорохром акридиновый оранжевый. В этом случае ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные - ярко-красное свечение. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом со­ставе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и воз­буждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцент­ной микроскопии .

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, неви­димых при обычных методах микроскопирования. Как уже указывалось, в обычном световом микроскопе необходимая контрастность структур дости­гается с помощью окрашивания. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной коль­цевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроско­па дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контра­ста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю прелом­ления. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнополъного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию структур в препарате, достигает объектива. Про­исходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя на­правляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие части­цы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Разре­шение этого микроскопа не может быть лучше, чем у светлопольного мик­роскопа, так как используется такая же длина волны. Но здесь достигается больший контраст. Он используется для изучения живых объектов, автора­диографических объектов, например зерен серебра, которые выглядят свет­лыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частно­сти treponema pallidum , вызывающей сифилис и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани, и диффе­ренциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который специально используют для изучения рельефа по­верхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделя­ется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колеба­ния, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяют­ся и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется эффект интерференции, возника­ющий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать клетки в про­цессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.

Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляри­зационных фильтра - первый (поляризатор) между пучком света, и объек­том, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Через пер­вый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось, которая располагается перпендикулярно первому филь­тру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Оба фильт­ра могут вращаться, изменяя направление пучка света. Если анализатор повернуть на 90° по отношению к поляризатору, то свет проходить через них не будет. Структуры, содержащие продольно ориентированные молеку­лы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллическиеструктуры (в клетках Лейдига 1) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образо­ваний к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикуляр­ную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью об­ладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии были создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 1, Б). В электронном микроскопе используется поток электронов с бо­лее короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. При напряже­нии 50 000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рас­считано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т.е. в 100 000 раз меньше; чем в световом мик­роскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешае­мое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и ска­нирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучае­мого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точ­ки поверхности. Для исследования выбранного участка микрозонд двигает­ся по его поверхности под действием отклоняющих катушек (принцип те­левизионной развертки). Такое исследование объекта называется сканиро­ванием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, - растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являют­ся большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия по методу замораживания - скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготов­ления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При иссле­довании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (око­ло 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 С С.

Метод электронной микроскопии «замораживание - травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующие­ся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них арте­фактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют ис­следовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультра-микротомии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 °С. Это обеспечива­ет торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности фер­ментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для выявления анти­генов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализа­цию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроско­пы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стерео­скопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Рентгеноструктурный анализ. Для изучения структуры макромолекул на ато­марном уровне применяют методы с использованием рентгеновских лучей, имеющих длину волны около 0,1 нм (диаметр атома водорода). Молекулы, образующие крис­таллическую решетку, изучают с помощью дифракционных картин, которые регист­рируют на фотопластинке в виде множества пятен различной интенсивности. Интен­сивность пятен зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. Положение пятен в дифракционной картине зависит от положения объек­та в системе, а их интенсивность свидетельствует о его внутренней атомной структуре.

Методы исследования фиксированных клеток и тканей

Исследование фиксированных клеток и тканей. Основным объектом ис­следования являются гистологические препараты, приготовленные из фик­сированных структур. Препарат может представлять собой мазок (напри­мер, мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозго­вой оболочки), тонкий срез. Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без спе­циальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют"слабый контраст, они плохо выявля­ются в обычном световом микроскопе и требуется использование специаль­ных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и элек­тронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация, 2) уплотнение материала, 3) приготовление срезов, 4) окрашивание или контрастирование срезов. Для световой мик­роскопии необходим еще один этап - заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды (5). Фиксация обеспечивает предотвращение про­цессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмие­вая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают терми­ческой обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фик­сированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей.

Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, произво­дится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала пара­фином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов производится на специальных приборах - микро­томах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии).

Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их соля­ми металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения кон­трастности изображения отдельных структур при рассматривании их в мик­роскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. Гистологические краси­тели подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной краситель азур II , который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый краситель - эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет. Избиратель­ное сродство структур к определенным красителям обусловлено их хими­ческим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окраши­вающиеся кислыми красителями, называются оксифильными (ацидофильны­ми, эозинофильными), а окрашивающиеся основными - базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, яв­ляются нейтрофилъными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обез­воженный гистологический срез заключают между предметным и по­кровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гис­тологический препарат может быть использован для изучения под микро­скопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы, полу­ченные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрас­тируют солями марганца, кобальта и др., после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объек­том изучения наряду с гистологическими препаратами.

Методы исследования живых клеток и тканей

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности - проследить движение, процессы деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их жизненного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов.

Прижизненные исследования клеток в организме (in vivo ). Одним из при­жизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме. С помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюми­наторов, например, можно изучать в динамике циркуляцию крови в мик­рососудах. После проведения анестезии у животного объект исследования (например, брыжейка кишечника) выводят наружу и рассматривают в мик­роскопе, при этом ткани должны постоянно увлажняться изотоническим раствором натрия хлорида. Однако длительность такого наблюдения огра­ничена. Лучшие результаты дает метод вживления прозрачных ка­мер в организм животного.

Наиболее удобным органом для вживления таких камер и последующего на­блюдения является ухо какого-либо животного (например, кролика). Участок уха с прозрачной камерой помещают на предметный столик микроскопа и в этих услови­ях изучают динамику изменения клеток и тканей в течение продолжительного вре­мени. Таким образом могут изучаться процессы выселения лейкоцитов из кровенос­ных сосудов, различные стадии образования соединительной ткани, капилляров, нервов и другие процессы. В качестве естественной прозрачной камеры можно ис­пользовать глаз экспериментальных животных. Клетки, ткани или образцы органов помещают в жидкость передней камеры глаза в угол, образованный роговицей и радужкой, и могут наблюдаться через прозрачную роговицу. Таким образом была произведена трансплантация оплодотворенной яйцеклетки и прослежены ранние стадии развития зародыша. Обезьянам были пересажены небольшие кусочки матки и изучены изменения слизистой оболочки матки в различные фазы менструального цикла.

Широкое применение нашел метод трансплантации клеток кро­ви и костного мозга от здоровых животных-доноров животным-реципиен­там, подвергнутым смертельному облучению. Животные-реципиенты после трансплантации оставались живыми вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток. Исследова­ние числа колоний и их клеточного состава позволяет выявлять количество родоначальных кроветворных клеток и различные стадии их дифференци­ровки. С помощью метода колониеобразования установлены источники раз­вития для всех клеток крови.

Витальное и суправитальное окрашивание. При витальном (прижиз­ненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм жи­вотного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточное вещество. Например, с помощью трипанового синего или литиевого кармина выявляют фагоциты, а с помощью ализа­рина - новообразованный матрикс кости.

Суправитальным окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом выявляют молодые фор­мы эритроцитов - ретикулоциты крови (краситель бриллиантовый крези-ловый голубой), митохондрии в клетках (краситель зеленый янус), лизосомы (краситель нейтральный красный).

Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro ). Этот метод является одним из самых распространенных. Выделенные из организма че­ловека или животных клетки, маленькие образцы тканей или органов по­мещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду, - плазму крови, эмбриональный экстракт, а так­же искусственные среды. Различают суспензионные культуры (клет­ки взвешены в среде), тканевые, органные и монослойные культуры (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечи­ваются стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют ос­новные показатели жизнедеятельности - способность к росту, размноже­нию, дифференцировке, движению. Такие культуры могут существовать многие дни, месяцы и даже годы, если обновлять среду культивирования и пересаживать жизнеспособные клетки в другие сосуды. Некоторые виды клеток благодаря изменениям в их геноме могут сохраняться и размножать­ся в культуре, образуя непрерывные клеточные линии. В разработку методов культивирования клеток и тканей большой вклад внесли А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. Г. Хлопин, А. Д. Тимофеевский, Ф. М. Лазаренко. В на­стоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпи-телиоцитов, макрофагов и др., которые существуют многие годы.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд зако­номерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, клеточных взаимодействий, взаимодействий клеток с вирусами и микроба­ми. Показана возможность хрящевых клеток формировать в культуре меж­клеточное вещество и способность клеток надпочечников продуцировать гормоны. Культивирование эмбриональных тканей и органов дало возмож­ность проследить развитие кости, кожи и других органов. Разработана мето­дика культивирования нервных клеток.

Особую значимость метод культуры тканей имеет для проведения эк­спериментальных наблюдений на клетках и тканях человека. Взятые из организма человека клетки при пункции или биопсии могут в культуре тканей использоваться для определения пола, наследственных заболева­ний, злокачественного перерождения, выявления действия ряда токсич­ных веществ.

В последние годы клеточные культуры широко применяются для гиб­ридизации клеток.

Разработаны методы разделения тканей на клетки, выделение отдельных типов клеток и их культивирования.

Вначале ткань превращают в суспензию клеток путем разрушения межклеточных контактов и межклеточного матрикса с помощью протеолитических ферментов (трип­син, коллагеназа) и соединений, связывающих Са 2+ (с помощью ЭДТА - этиленди-аминтетрауксусной кислоты). Далее полученную суспензию разделяют на фракции клеток различных типов с помощью центрифугирования, позволяющего отделить более тяжелые клетки от легких, большие от малых, или путем прилипания клеток к стеклу или пластмассе, способность к которому у различных типов клеток неодина­кова. Для обеспечения специфического прилипания клеток к поверхности стекла ис­пользуют антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа. Прилип­шие клетки затем отделяют, разрушая матрикс ферментами, при этом получают взвесь однородных клеток. Более тонким методом разделения клеток является мече-ние антителами, связанными с флюоресцирующими красителями. Меченые клетки отделяются от немеченых с помощью сортера (электронного флюоресцентно-активи­руемого клеточного анализатора). Клеточный анализатор сортирует в 1 с около 5000 клеток. Выделенные клетки можно изучать в условиях культивирования.

Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, раз­множение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками, влияние гор­монов, факторов роста и др.

Культуры обычно готовят из суспензии клеток, полученной вышеописанным методом диссоциации ткани. Большинство клеток неспособны расти в суспензии, им необходима твердая поверхность, в качестве которой используют поверхность пластиковой культуральной чашки, иногда с компонентами внеклеточного матрик-са, например коллагена. Первичными культурами называют культуры, приготовлен­ные непосредственно после первого этапа фракционирования клеток, вторичны­ми - культуры клеток, пересаженные из первичных культур в новую среду. Можно последовательно перевивать клетки в течение недель и месяцев, при этом клетки сохраняют характерные для них признаки дифференцировки (например, клетки эпителия образуют слои). Исходным материалом для клеточных культур обычно слу­жат эмбриональные ткани и ткани новорожденных.

В качестве питательных сред используют смеси солей, аминокислот, витами­нов, лошадиной сыворотки, экстракт куриных эмбрионов, эмбриональную сыво­ротку и др. В настоящее время разработаны специальные среды для культивирова­ния различных типов клеток. Они содержат один или несколько белковых факторов роста, необходимых клеткам для жизнедеятельности и размножения. Например, для роста нервных клеток необходим фактор роста нервов (ФРН).

У большинства клеток в культуре наблюдается определенное число делений (50-100), а затем они погибают. Иногда в культуре появляются мутантные клетки, которые размножаются бесконечно и образуют клеточную линию (фибробласты, эпителиоциты, миобласты и др.). Мутантные клетки отличаются от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, но могущих расти без прикрепления к твердой поверхности. Раковые клетки в культуральных чашках образуют более плот­ную популяцию, чем популяции обычных клеток. Аналогичное свойство можно вызвать экспериментально у нормальных клеток путем трансформации их опухоле-родными вирусами или химическими соединениями, при этом образуются неопла-стически трансформированные клеточные линии. Клеточные линии нетрансформи-рованных и трансформированных клеток можно длительно сохранять при низких температурах (-70 °С). Генетическую однородность клеток усиливают клонировани­ем, когда из одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию однородных клеток. Клон - это популяция клеток, происходящих из од­ной клетки-предшественника.

Клеточные гибриды. При слиянии двух клеток различных типов образу­ется гетерокарион - клетка с двумя ядрами. Для получения гетерока-риона суспензию клеток обрабатывают полиэтиленгликолем или инактиви-рованными вирусами для повреждения плазмолемм клеток, после чего клет­ки способны к слиянию. Например, неактивное ядро эритроцита курицы становится активным (синтез РНК, репликация ДНК) при слиянии кле­ток и переносе в цитоплазму другой клетки, растущей в культуре ткани. Ге­терокарион способен к митозу, в результате чего образуется гибридная клет­ка. Оболочки ядер у гетерокариона разрушаются, и их хромосомы объеди­няются в одном большом ядре.

Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома. Например, в гибридной клеточной линии «мышь - человек» установлена роль хромо­сомы 11 человека в синтезе инсулина.

Гибридомы. Клеточные линии гибридом используют для получения мо-ноклональных антител. Антитела вырабатываются плазмоцитами, которые образуются из В-лимфоцитов при иммунизации. Определенный вид анти­тел получают при иммунизации мышей конкретными антигенами. Если клонировать такие иммунизированные лимфоциты, то можно получить большое количество однородных антител. Однако время жизни В-лимфоци­тов в культуре ограничено. Поэтому производят их слияние с «бессмертны­ми» опухолевыми клетками (В-лимфомы). В результате образуются гибридо мы (гибрид-клетка, с геномом от двух разных клеток; ома - окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Каждый клон гиб­ридомы является источником моноклональных антител. Все молекулы анти­тел данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания анти­генов. Можно получать моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке, и использовать их для установления локализации белков в клетке, а также для выделения белка из смеси (очистка белков), что позволяет исследовать структуру и функцию белков. Моноклональные антитела применяют также в технологии клонирования генов.

Антитела можно использовать для изучения функции различных моле­кул, вводя их через плазмолемму непосредственно в цитоплазму клеток тонкой стеклянной пипеткой. Например, введение антител к миозину в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки морского ежа останавливает раз­деление цитоплазмы.

Технология рекомбинантных ДНК. Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных орга­низмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы гибридизации широко используют в современной биологии для изучения структуры генов и их экспрессии.

Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей

Для изучения химического состава биологических структур - локали­зации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма при­меняют специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять лока­лизацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и ор­ганов - ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минераль­ных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, вхо­дящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для повышения специфичности реакции часто при­меняют ферментативный контроль. Например, для выявления в клетках ри­бонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин - краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обра­боткой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеа­зой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверж­дает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочислен­ных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

В последние годы сочетание гистохимических методов с методом элек­тронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направ­ления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать ло­кализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях.

Для изучения макромолекул клеток используют очень чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител, позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее 1000).

Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные части­цы (электроны) или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать в специальных приборах. Радиоактивные изотопы исполь­зуют в методе радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3 Н-тимидина исследуют ДНК ядра, с помощью 3 Н-уридина - РНК.

Метод радиоавтографии. Этот метод дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в разных структурах. В основе метода лежит исполь­зование радиоактивных элементов (например, фосфора - 32 Р, углерода - 14 С, серы - 35 S , водорода - 3 Н) или меченных ими соединений. Радиоак­тивные вещества в гистологических срезах обнаруживают с помощью фото­эмульсии, которую наносят на препарат и затем проявляют. В участках пре­парата, где фотоэмульсия соприкасается с радиоактивным веществом, про­исходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участ­ки (треки). Этим методом можно определять, например, скорость включе­ния меченых аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, об­мен йода в клетках щитовидной железы и др.

Методы иммунофлюоресцентного анализа. Применение антител. Антите­ла - защитные белки, вырабатываемые плазмоцитами (производными В-лимфоцитов) в ответ на действие чужеродных веществ (антигенов). Ко­личество различных форм антител достигает миллиона. Каждое антитело имеет участки для «узнавания» молекул, вызвавших синтез этого антитела. В связи с высокой специфичностью антител в отношении антигенов они могут быть использованы для выявления любых белков клетки. Для выявле­ния локализации белков антитела окрашивают флюоресцирующими краси­телями, а затем клетки изучают с помощью флюоресцентной микроскопии. Антитела можно использовать также для изучения антигенов на ультра­структурном уровне с помощью электронного микроскопа. Для этого анти­тела метят электронно-плотными частицами (микросферы коллоидного зо­лота). Для усиления специфичности реакции применяют моноклональные антитела, образуемые линией клеток, - клонами, полученной методом гибридом из одной клетки. Метод гибридом позволяет получать монокло­нальные антитела с одинаковой специфичностью и в неограниченных ко­личествах.

Методы иммунофлюоресцентного анализа широко и эффективно ис­пользуются в современной гистологии. Эти методы применяются для изуче­ния процессов дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и структур. Они основаны на реакциях антиген - антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный со­став, который главным образом определяется белками. Продукты реакции можно окрашивать и выявлять в люминесцентном микроскопе, например выявление актина и тубулина в клетке с помощью метода иммунофлюорес­центного анализа (см. главу IV ).

Современные методы исследований позволяют проводить анализ хими­ческого состава различных структурных компонентов клеток, как фиксиро­ванных, так и живых. Изучение отдельных внутриклеточных структур стало возможным после разработки технологий фракционирования клеточного содержимого.

Фракционирование клеточного содержимого

Фракционировать структуры и макромолекулы клеток можно различны­ми методами - ультрацентрифугированием, хроматографией, электрофо­резом. Подробнее эти методы описаны в учебниках биохимии.

Ультрацентрифугирование. С помощью этого метода клетки можно разделить на органеллы и макромолекулы. Вначале разрушают клет­ки осмотическим шоком, ультразвуком или механическим воздействием. При этом мембраны (плазмолемма, эндоплазматический ретикулум) распадаются на фрагменты, из которых формируются мельчайшие пу­зырьки, а ядра и органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы) сохраняются интактными и находятся в образующей сус­пензии.

Для разделения вышеуказанных компонентов клетки применяют высо­коскоростную центрифугу (80 000-150 000 оборотов/мин). Вначале оседают (седиментируют) на дне пробирки более крупные части (ядра, цитоскелет). При дальнейшем увеличении скоростей центрифугирования надосадочных фракций последовательно оседают более мелкие частицы - сначала мито­хондрии, лизосомы и пероксисомы, затем микросомы и мельчайшие пу­зырьки и, наконец, рибосомы и крупные макромолекулы. При центрифу­гировании различные фракции оседают с различной скоростью, образуя в пробирке отдельные полосы, которые можно выделить и исследовать. Фрак­ционированные клеточные экстракты (бесклеточные системы) широко ис­пользуют для изучения внутриклеточных процессов, например для изуче­ния биосинтеза белка, расшифровки генетического кода и др.

Хроматография широко используется для фракционирования бел­ков.

Электрофорез позволяет разделить белковые молекулы с различным зарядом при помещении их водных растворов (или в твердом пористом матриксе) в электрическом поле.

Методы хроматографии и электрофореза применяют для анализа пеп­тидов, получаемых при расщеплении белковой молекулы, и получения так называемых пептидных карт белков. Подробно эти методы описаны в учеб­никах биохимии.

Изучение химического состава живых клеток. Для изучения распределе­ния веществ и их метаболизма в живых клетках используют методы ядерно­го магнитного резонанса и микроэлектродную технику.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) позволяет изучать малые моле­кулы низкомолекулярных веществ. Образец ткани содержит атомы в различных мо­лекулах и в различном окружении, поэтому он будет поглощать энергию на различ­ных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для дан­ного образца составит его спектр ЯМР. В биологии сигнал ЯМР от протонов (ядер водорода) широко используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и др. Для изучения макромолекул внутри живой клетки часто применяют изотопы 3 Н, 13 С, 35 К, 31 Р для получения сигнала ЯМР и слежения за его изменением в процессе жиз­недеятельности клетки. Так, 3| Р используется для изучения мышечного сокращения - изменений содержания в тканях АТФ и неорганического фосфата. Изотоп 13 С по­зволяет с помощью ЯМР исследовать многие процессы, в которых участвует глю­коза. Использование ЯМР ограничено его низкой чувствительностью: в 1 г живой ткани должно содержаться не менее 0,2мм исследуемого вещества. Преимуществом метода является его безвредность для живых клеток.

Микроэлектродная техника. Микроэлектроды представляют собой стеклянные трубочки, заполненные электропроводным раствором (обычно раствор КС1 в воде), диаметр конца которых измеряется долями микрона. Кончик такой тру­бочки можно вводить в цитоплазму клетки через плазмолемму и определять кон­центрацию ионов Н + , Na + , К + , С1", Са 2+ , Mg 2+ , разность потенциалов на плазмо-лемме, а также производить инъекцию молекул в клетку. Для определения концен­трации конкретного иона используют ионселективные электроды, которые запол­няют ионообменной смолой, проницаемой только для данного иона. В последние годы микроэлектродную технику применяют для изучения транспорта ионов через специальные ионные каналы (специализированные белковые каналы) в плазмолем-ме. При этом используют микроэлектрод с более толстым кончиком, который плот­но прижимают к соответствующему участку плазмолеммы. Этот метод позволяет ис­следовать функцию одиночной белковой молекулы. Изменение концентрации ионов внутри клетки можно определить с помощью люминесцирующих индикаторов. На­пример, для изучения внутриклеточной концентрации Са 2+ используют люминес­центный белок акварин (выделен из медузы), который излучает свет в присутствии ионов Са 2+ и реагирует на изменение концентрации последнего в пределах 0,5- 10 мкМ. Синтезированы также флюоресцентные индикаторы, прочно связывающи­еся с Са 2+ . Создание различных новых типов внутриклеточных индикаторов и совре­менных способов анализа изображений позволяет точно и быстро определять внут­риклеточную концентрацию многих низкомолекулярных веществ.

Количественные методы

В настоящее время наряду с качественными методами разработаны и применяются количественные гистохимические методы опре­деления содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность количественно-гистохимических (в отличие от биохимических) методов исследования заключается в возможности изучения концентрации и содер­жания химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Цитоспектрофотометрия - метод количественного изучения внутрикле­точных веществ по их абсорбционным спектрам.

Цитоспектрофлюориметрия - метод количественного изучения внутри­клеточных веществ по спектрам их флюоресценции или по интенсивности флюоресценции на одной заранее выбранной волне (цитофлюориметрия).

Современные микроскопы - цитофлюориметры позволяют обнаружить в различных структурах малые количества вещества (до 10~ 14 -10~ 16 г) и оце­нить локализацию исследуемых веществ в микроструктурах.

Методы анализа изображения клеточных и тканевых структур

Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на телевизи­онном экране дисплея, на электронных микрофотографиях могут подвер­гаться специальному анализу - выявлению морфометрических, денситомет-рических параметров и их статистической обработке.

Морфометрические методы позволяют определять с помощью специаль­ных сеток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, их площади, диаметры и др. В частности, в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазмати-ческие отношения и др. Существуют ручная морфометрия и авто­матизированная морфометрия, при которой все параметры изме­ряются и регистрируются в приборе автоматически.

В последние годы все большее распространение получают автоматизи­ рованные системы обработки изображений (АСОИз), позволяющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количе­ственной микроскопии дополняются методами анализа и распознавания образцов, основанными на обработке с помощью электронных вычисли­тельных машин (ЭВМ) информации, извлекаемой из изображений клеток и тканей. По существу можно говорить об устройствах, не только усилива­ющих оптические возможности зрительного анализатора человека, но и многократно расширяющих его аналитические возможности. Высказывается мнение, что АСОИз совершает такой же переворот в морфологии, какой около 300 лет назад произошел благодаря изобретению светового, а около 50 лет назад - электронного микроскопа, поскольку они не только неиз­меримо повышают производительность труда исследователя и не только объективизируют наблюдения, но и позволяют получать новую информа­цию о невыявляемых ранее процессах, численно моделировать и прогнози­ровать их развитие в клетках и тканях.

Вместе с тем участие в эксперименте ЭВМ требует от исследователя нового подхода к его проведению, владения навыками составления алго­ритмов процесса исследования, точности рассуждений и в конечном итоге повышения научно-методического уровня исследования.

Одним из методов, существенно расширивших число решаемых морфо­логических задач, является оптико-структурный машинный анализ (ОСМА), предложенный в 1965 г. К.М.Богдановым. В 1978 г. автор метода был удосто­ен Государственной премии СССР. С появлением ОСМА сделан качествен­но новый шаг в разработке единой методологии количественного анализа микроструктур на основе статистических характеристик. В последнее время ОСМА нашел эффективное применение в исследовательской практике и народном хозяйстве.

На рис. 2 представлена созданная в нашей стране фирмой «ЛОМО» ав­томатизированная система обработки изображений «Протва-МП». Система предназначена для проведения комплексных исследований клеток и тканей с использованием методов абсорбционной, флюоресцентной микроскопии и радиоавтографии.

Входящий в состав системы специальный сканирующий оптический или электронный микроскоп осуществляет последовательный просмотр изображения препарата по двум координатам, преобразуя его в цифровую форму, и вводит в ЭВМ, которая в свою очередь производит цифровую обработку изображения и выдает информацию о геометрических и других характеристиках анализируемого объекта.

С помощью цветного дисплея исследователь может «препарировать» изображе­ние, выделяя лишь те структурные составляющие, которые его интересуют. Входя­щие в состав ЭВМ емкие накопители информации на магнитных дисках или лентахпозволяют запоминать как сами изображения, так и результаты их обработки для последующего хранения и документирования

Использование методов автоматизированного анализа микрообъектов рассмотрим на примере обработки изображения лейкоцита крови (рис 3) Сканирующий микроскоп-фотометр позволяет построчно «просматривать» значения оптической плотности с шагом, заданным исследователем В ре­зультате оптический сигнал, соответствующий оптической плотности объекта, преобразуется в цифровую форму Полученная цифровая матри­ца подлежит препаровке с помощью специального математического аппа­рата

Вначале убирается фон и вычленяется «чистый» объект - изображение клетки (1а), затем из изображения клетки выделяется любая интересующая исследователя деталь, например цитоплазма (16) и ядро (I порядка среднее и ин­тегральное значение оптической плотности, дисперсия, асимметрия, эксцесс и др По изображению объекта получают морфометрические параметры пло­щадь, периметр, диаметр, ядерно-цитоплазматическое отношение, коэффициент формы и др

Следующим этапом обработки изображения является построение двухмер­ных диаграмм взаимозависимости оптической плотности для всей клетки (см рис 3), ее цитоплазмы (Шб) и ядра (Шв) Так же, как и в первом случае, на диа­грамме всей клетки (Ша) можно выделить фазу цитоплазмы и ядра Данные диа­граммы позволяют рассчитать гистограммные параметры II порядка гомоген­ность, локальный контраст, энтропию и др.

Рис. З. Автоматизированная обработка изображения клетки (схема).

Изображение лейкоцита (а), его цитоплазмы (б) и ядра (в). I - цифровое изображение; II - гистограммы оптической плотности; III - двухмерные гистограммы зависимости значений оптической плотности.

Полученные таким образом параметры представляют многомерный «портрет» клетки и имеют конкретное числовое выражение. Они могут быть подвергнуты различным методам статистической обработки, позволяют предельно точно классифицировать микрообъекты, выявлять особенности их структуры, необнаруживаемые визуально.

Таким образом, применение новых методов исследований в гистологии, цитологии и эмбриологии позволяет выяснить общие закономерности орга­низации тканей и клеток, структурные основы биохимических процессов, определяющих функцию конкретных структурных компонентов клетки.

Строение, ультраструктура и функционирование клеточных органоидов исследуется в настоящее время с помощью следующих основных методов: световой и электронной, темнопольной, фазово-контрастной, поляризационной, люминесцентной микроскопии , используемых для изучения строения, ультраструктуры фиксированных клеток, и дифференциального центрифугирования, позволяющего выделять отдельные органоиды и анализировать их цитохимическими, биохимическими, биофизическими, и другими методами.

Световая микроскопия.

Принцип метода состоит в том, что пучок света, пройдя через объект, попадает в систему линз объектива, и строит первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив.

В современных микроскопах объективы сменные, что позволяют изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность, т.е. способность давать раздельное изображение двух близких друг к другу объектов.

Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например проекции на экран (до 10 5 раз). Разрешающая способность светового микроскопа ограничивается длиной волны света: чем меньше длина волны, тем выше разрешающая способность. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать фиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130 - 140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света.

Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.

Электронная микроскопия.

Для сканирующего электронного микроскопа материал часто замораживают, чтобы получить поверхность, покрытую льдом. При этом исключаются потери воды водорастворимых веществ, меньшими являются также химические изменения структур. При анализе данных, полученных с помощью электронного микроскопа, надо помнить, что этим методом исследуются статические состояния клетки в момент быстрой остановки движения цитоплазмы, вызванной воздействием фиксирующих химических веществ.

Темнопольная микроскопия .

Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.

Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток широко используют метод авторадиографии - регистрации веществ, меченых изотопами. Например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.

В цитологии применяют различные аналитические и препаративные методы биохимии. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные клеточные компоненты и изучать их химию, ультраструктуру и свойства. В настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры.

Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения состоит в том, что время для оседания частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Чтобы ускорить этот процесс оседания используют ускорения, создаваемые центрифугой.

При повторном дробном центрифугировании смешанных подфракции можно получить чистые фракции. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе. Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.

Контрольные вопросы:

1. Уровни организации живой материи

2. Клеточная теория организации организмов

3. Методы исследования в цитологии

4. Задачи и предмет цитологии

5. Устройство светового микроскопа

6. Устройство электронного микроскопа

7. Техника безопасности при цитологических работах

8. Требования к подготовке биологического материала для цитологического исследования

9. Фиксирующие вещества, механизм действия

10. Цитохимия, требования к материалу и возможности

11. Количественный анализ (морфометрия), требования и возможности

12. Артефакты в цитологии, пути объективизации результатов

1. Заварзин А.А., Харазова А.Д. Основы общей цитологии. - Л., 1982.

2. Ченцов Ю.С. Основы цитологии. - М., 1984.

3. Шубникова Е.А. Функциональная морфология тканей. - М., Изд-во МГУ, 1981.

За последние 4045 лет цитология из описательно-морфологической превратилась в экспериментальную науку ставящую перед собой задачи изучения физиологии клетки ее основных жизненных функций и свойств ее биологии. Другими словами – это физиология клетки. Карнуа Биология клетки вышедшей в 1884 г. Выделим некоторые важные вехи в истории изучения биологии клетки.

Поделитесь работой в социальных сетях

Если эта работа Вам не подошла внизу страницы есть список похожих работ. Так же Вы можете воспользоваться кнопкой поиск

Лекция №1

ВВЕДЕНИЕ В ЦИТОЛОГИЮ

Предмет и задачи курса цитологии.

Место цитологии в системе биологических дисциплин

Цитология (от греч. Kytos – ячейка, клетка) – наука о клетке. Современная цитология изучает строение клеток, их функционирование как элементарных живых систем; исследует функции отдельных клеточных компонентов, процессы воспроизведения клеток, их приспособления к условиям среды и многие другие процессы, позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях.

Цитология рассматривает также особенности специализированных клеток, этапы становления их особых функций и развития специфических клеточных структур.

За последние 40-45 лет цитология из описательно-морфологической превратилась в экспериментальную науку, ставящую перед собой задачи изучения физиологии клетки, ее основных жизненных функций и свойств, ее биологии. Другими словами – это физиология клетки.

Возможность такого переключения интересов исследователей возникла в связи с тем, что цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики.

Вообще, цитология тесно связана практически со всеми биологическими дисциплинами, так как все живое на Земле (почти все!) имеет клеточное строение, а цитология как раз и занимается изучением клеток во всем их многообразии.

Цитология тесно связана с зоологией и ботаникой, поскольку изучает особенности строения растительных и животных клеток; с эмбриологией при изучении строения половых клеток; с гистологией – строение клеток отдельных тканей; с анатомией и физиологией, так как на основе цитологических знаний изучается строение тех или иных органов и их функционирование.

Клетка имеет богатый химический состав, в ней протекают сложные биохимические процессы – фотосинтез, биосинтез белка, дыхание, а также происходят важные физические явления, в частности, возникновение возбуждения, нервного импульса, поэтому цитология тесно связана с биохимией и биофизикой.

Чтобы понять сложные механизмы наследственности, нужно изучить и понять их материальные носители – гены, ДНК, которые являются составными компонентами клеточных структур. Из этого возникает тесная связь цитологии с генетикой и молекулярной биологией.

Данные цитологических исследований широко используются в медицине, сельском хозяйстве, ветеринарии, в различных отраслях промышленности (пищевая, фармацевтическая, парфюмерная и др.). Важное место также занимает цитология в преподавании биологии в школе (курс общей биологии в старших классах).

Краткий исторический очерк развития цитологии

В целом цитология – наука довольно молодая. Из среды других биологических наук она выделилась немногим более ста лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книге Ж.Б. Карнуа «Биология клетки», вышедшей в 1884 г. Появлению этой книги предшествовал длительный и бурный период поисков, открытий, дискуссий, который привел к формулированию так называемой клеточной теории, имеющей огромное общебиологическое значение.

Выделим некоторые важные вехи в истории изучения биологии клетки.

Конец 16 – начало 17 столетия. Изобретателями микроскопа по разным данным являются Захария Янсен (1590 г., Голландия), Галилео Галилей (1610 г., Италия), Корнелиус Дреббель (1619-1620 гг., Голландия). Первые микроскопы были весьма громоздкими и дорогими и использовались знатными людьми для собственного развлечения. Но постепенно они усовершенствовались и стали превращаться из игрушки в инструмент научных исследований.

1665 г. Роберт Гук (Англия), пользуясь микроскопом, сконструированным английским физиком Х. Гюйгенсом, изучал строение пробки и впервые употребил термин «клетка» для описания структурных единиц, из которых состоит эта ткань. Он считал, что клетки пустые, а живое вещество – это клеточные стенки.

1675- 1682 гг. М. Мальпиги и Н. Грю (Италия) подтвердили клеточное строение растений

1674 г. Антонио ван Левенгук (Голландия) открыл одноклеточные организмы, в том числе бактерии (1676 г.). Он же впервые увидел и описал животные клетки – эритроциты крови, сперматозоиды.

1827 г. Долланд резко улучшил качество линз. После этого интерес к микроскопии быстро возрос и распространился.

1825 г. Ян Пуркине (Чехия) первым описывает клеточное ядро в яйцеклетке птиц. Он называет его «зародышевым пузырьком» и закрепляет за ним функцию «производящей силы яйца».

1827 г. Русский ученый Карл Бэр открыл яйцеклетку млекопитающих и установил, что все многоклеточные организмы начинают свое развитие из одной клетки. Это открытие показало, что клетка – единица не только строения, но и развития всех живых организмов.

1831 г. Роберт Броун (английский ботаник) впервые описал ядро в растительных клетках. Он придумал название «нуклеус» – «ядро» и впервые заявил, что оно обычная составная часть любой клетки, имеющая некое существенное значение для ее жизни.

1836 г. Габриель Валентин, ученик Пуркине, открывает ядро животных клеток – клеток эпителия конъюнктивы, соединительной оболочки глаза. Внутри этого «нуклеуса» он находит и описывает ядрышко.

С этого момента ядро стали выискивать и находить во всех тканях растений и животных.

1839 г. Теодор Шванн (немецкий физиолог и цитолог) опубликовал книгу «Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте животных и растений», в которой он обобщил имеющиеся знания о клетке, в том числе результаты исследований немецкого ботаника Матиаса Якоба Шлейдена о роли ядра в клетках растений. Главная идея книги (потрясающая по своей простоте) – жизнь сосредоточена в клетках – вызвала революцию в биологии. Иными словами Т. Шванн и М. Шлейден сформулировали клеточную теорию. Основные ее положения тогда были следующие:

1) как растительные, так и животные организмы состоят из клеток;

2) клетки растительных и животных организмов развиваются аналогично и близки друг к другу по строению и функциональному назначению;

3) каждая клетка способна к самостоятельной жизнедеятельности.

Клеточная теория – одно из выдающихся обобщений биологии XIX в., давшее основу для понимания жизни и раскрытия эволюционных связей между организмами.

1840 г. Ян Пуркине предложил название «протоплазма» для клеточного содержимого, убедившись в том, что именно оно (а не клеточные стенки) представляют собой живое вещество. Позднее был введен термин «цитоплазма».

1858 г. Рудольф Вирхов (немецкий патолог и общественный деятель) показал, что все клетки образуются из других клеток путем клеточного деления. Это положение в дальнейшем также вошло в клеточную теорию.

1866 г. Эрнст Геккель (немецкий биолог, основоположник филогенетического направления дарвинизма) установил, что хранение и передачу наследственных признаков осуществляет ядро.

1866-1888 гг. Подробно изучено клеточное деление и описаны хромосомы.

1880-1883 гг. Открыты пластиды, в частности хлоропласты.

1876 г. Открыт клеточный центр.

1989 г. – Открыт аппарат Гольджи.

1894 г. Открыты митохондрии.

1887-1900 гг. Усовершенствованы микроскоп, а также методы фиксации, окрашивания препаратов и приготовления срезов. Цитология начала приобретать экспериментальный характер. Ведутся эмбриологические исследования, чтобы выяснить, каким образом клетки взаимодействуют друг с другом в процессе роста многоклеточного организма.

1900 г. Вновь открыты законы Менделя, забытые с 1865 г., и это дало толчок развитию цитогенетики, занимающейся изучением роли ядра в передаче наследственных признаков.

Световой микроскоп к этому времени почти достиг теоретического предела разрешения; развитие цитологии естественно замедлилось.

1930-е годы Появился электронный микроскоп.

С 1946 г. и по настоящее время электронный микроскоп получил широкое распространение в биологии, дав возможность исследовать строение клетки гораздо более подробно. Это «тонкое» строение стали называть ультраструктурой.

Роль отечественных ученых в развитии учения о клетке.

Каспар Фридрих Вольф (1733-1794) – член Петербургской АН, выступал против метафизических представлений о развитии как росте уже готового организма, заложенного в половой клетке (теория преформизма).

П.Ф. Горянинов – русский биолог, описавший различные формы клеток и еще до Шванна и Шлейдена высказывавший близкие к ним взгляды.

Вторая половина XIX в. – начало ХХ в.: русский цитолог И.Д. Чистяков впервые описал митоз в спорах плауна; И.Н. Горожанкин изучал цитологические основы оплодотворения у растений; С.Т. Навашин в 1898 г. открыл двойное оплодотворение у растений.

Основные положения современной клеточной теории

1. Клетка как элементарная живая система, способная к самообновлению, саморегуляции и самовоспроизведению, лежит в основе строения и развития всех живых организмов.

2. Клетки всех организмов построены по единому принципу, сходны (гомологичны) по химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ.

3. Размножение клеток происходит путем их деления, и каждая новая клетка образуется в результате деления материнской клетки.

4. В многоклеточных организмах клетки специализированы по выполняемым функциям и образуют ткани. Из тканей состоят органы и системы органов, которые тесно связаны между собой.

С развитием науки лишь одно положение клеточной теории оказалось не абсолютно верным – первое. Не все живые организмы имеют клеточную организацию. Это стало ясным с открытием вирусов. Это неклеточная форма жизни, но существование и размножение вирусов возможно только при использовании ферментативных систем клеток. Поэтому вирус не является элементарной единицей живой материи.

Клеточная форма организации живого, возникнув однажды, стала основой всего дальнейшего развития органического мира. Эволюция бактерий, простейших, сине-зеленых водорослей и других организмов целиком происходила за счет структурных, функциональных и биохимических преобразований клетки. В ходе этой эволюции было достигнуто поразительное разнообразие клеточных форм, однако общий план строения клетки не претерпел принципиальных изменений.

Возникновение многоклеточности резко расширило возможности прогрессивной эволюции органических форм. Ведущими здесь стали изменения систем более высокого порядка (тканей, органов, индивидов, популяций и т.д.). При этом у тканевых клеток закреплялись особенности, полезные для индивида и вида в целом, независимо от того, как данная особенность сказывается на жизнеспособности и способности к размножению самих тканевых клеток. В результате – клетка стала подчиненной частью целостного организма. Например, функционирование ряда клеток связано с их гибелью (секреторные клетки), утратой способности к размножению (нервные клетки), утратой ядра (эритроциты млекопитающих).

Методы современной цитологии

Цитология возникла как ветвь микроанатомии, и поэтому основной метод, который используют цитологи – это метод световой микроскопии. В настоящее время этот метод нашел целый ряд дополнений и модификаций, что значительно расширило круг задач и вопросов, решаемых цитологией. Революционным моментом в развитии современной цитологии и биологии вообще было применение электронной микроскопии, открывшей необычайно широкие перспективы. С введением электронной микроскопии в ряде случаев уже трудно провести границу между собственно цитологией и биохимией, они объединяются на уровне макромолекулярного изучения объектов (например, микротрубочек, мембран, микрофиламентов и т.д.). Все же главным методическим приемом в цитологии остается визуальное наблюдение объекта. Кроме того, в цитологии применяются многочисленные приемы препаративной и аналитической биохимии, методы биофизики.

Познакомимся с некоторыми методами цитологических исследований, которые для удобства изучения разделим на несколько групп.

I . Оптические методы .

1. Световая микроскопия. Объекты исследования – препараты, которые можно рассматривать в проходящем свете. Они должны быть достаточно прозрачны, тонки и контрастны. Биологические объекты не всегда обладают этими качествами. Для изучения их в биологическом микроскопе необходимо предварительно приготовить соответствующие препараты путем фиксации, обезвоживания, изготовления тонких срезов, окрашивания. Клеточные структуры в таких фиксированных препаратах не всегда соответствуют истинным структурам живой клетки. Их изучение должно сопровождаться изучением живого объекта в темнопольном и фазово-контрастном микроскопах, где контрастность повышается за счет дополнительных устройств к оптической системе.

Предельное разрешение, которое может дать биологический микроскоп при масляной иммерсии, - 1700 Ǻ (0,17 мкм) в монохроматическом свете и 2500 Ǻ (0,25 мкм) в белом свете. Дальнейшее увеличение разрешения может идти лишь за счет уменьшения длины волны света.

2. Темнопольная микроскопия . Метод основан на принципе рассеивания света на границе между фазами с разными показателями преломления. Достигается это в темнопольном микроскопе или в обычном биологическом микроскопе специальным темнопольным конденсором, который пропускает только очень косые краевые лучи источника света. Поскольку краевые лучи имеют сильный наклон, они не попадают в объектив, и поле зрения микроскопа оказывается темным, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым. На препаратах клеток обычно содержатся структуры разной оптической плотности. На общем темном фоне эти структуры четко видны благодаря их различному свечению, а светятся они потому, что рассеивают попадающие на них лучи света (эффект Тиндаля).

В темном поле можно изучать живые объекты. Разрешающая способность такого микроскопа большая (меньше 0,2 мкм).

3. Фазово-контрастная микроскопия . Метод основан на том, что отдельные участки прозрачного препарата отличаются от окружающей среды по показателю преломления. Поэтому проходящий через них свет распространяется с различной скоростью, т.е. испытывает смещение фаз, что выражается в изменении яркости. Частицы с показателем преломления, большим показателя преломления среды, дают темные изображения на светлом фоне, с показателем, меньшим показателя среды, - изображения более светлые, чем окружающий фон.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет выявить множество деталей и особенностей живых клеток и срезов тканей. Большое значение имеет этот метод для изучения тканей, культивируемых in vitro .

4. Интерференционная микроскопия . Этот метод близок к методу фазово-контрастной микроскопии и дает возможность получить контрастные изображения неокрашенных прозрачных живых клеток, а также вычислить сухой вес клеток. Интерференционный микроскоп устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.

II . Витальное (прижизненное) изучение клеток.

1. Приготовление препаратов живых клеток. Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. В любом из этих случаев клетки изучаются в специально подобранных средах (вода, физиологический раствор, раствор Рингера и др.).

2. Метод клеточных культур . Культивирование клеток и тканей вне организма (in vitro ) связано с соблюдением определенных условий; подбирается подходящая питательная среда, поддерживается строго определенная температура (около 20 0 для клеток холоднокровных животных и около 37 0 для теплокровных), обязательным является соблюдение стерильности и регулярные пересевы культуры на свежую питательную среду. Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.

3. Методы микрохирургии . Данные методы предполагают оперативное воздействие на клетку. Микрооперации на отдельных клетках мелких размеров стали проводить с начала ХХ столетия, когда был сконструирован прибор, называемый микроманипулятором. С его помощью клетки разрезают, извлекают из них отдельные части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки.

4. Методы прижизненной окраски . При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) или основной (нейтральный красный, метиленовый синий) природы, применяемые при очень большом разведении (1:200000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра. Время для окрашивания препаратов сильно варьирует, но для большинства витальных красителей оно равно от 15 до 60 минут.

III . Цитофизические методы

1. Метод поглощения рентгеновских лучей . Метод основан на том, что разные вещества в определенной длине волны по-разному поглощают рентгеновские лучи. Пропуская рентгеновские лучи через препарат ткани, можно по спектру поглощения определить ее химический состав.

2. Флуоресцентная микроскопия . В основу метода положено свойство некоторых веществ флуоресцировать в ультрафиолетовых лучах. Для этих целей используют ультрафиолетовый микроскоп, в конденсоре которого установлен светофильтр, выделяющий из общего светового пучка синие и ультрафиолетовые лучи. Другой светофильтр, помещенный перед глазами наблюдателя, поглощает эти лучи, пропуская лучи флуоресценции, испускаемые препаратом. Источником света служат ртутные лампы и лампы накаливания, дающие сильное ультрафиолетовое излучение в общем световом пучке.

Флуоресцентная микроскопия дает возможность изучать живую клетку. Целый ряд структур и веществ, содержащихся в клетках, обладает собственной (первичной) флуоресценцией (хлорофилл, витамины А, В 1 и В 2 , некоторые гормоны и бактериальные пигменты). Объекты, не обладающие собственной флуоресценцией, могут быть подкрашены специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами . Тогда они просматриваются в ультрафиолете (вторичная флуоресценция). С помощью этого метода можно видеть форму объекта, распределение флуоресцирующих веществ в объекте, содержание этих веществ).

3. Метод радиографии . Метод основан на том, что радиоактивные изотопы, будучи введенными в организм, вступают в общий клеточный обмен и включаются в молекулы соответствующих веществ. Места их локализации определяют по излучению, даваемому изотопами и обнаруживаемому по засвечиванию фотопластинки при наложении ее на препарат. Препарат изготовляется спустя некоторое время после введения изотопа с учетом времени прохождения определенных стадий метаболизма. Этот метод широко применяется для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток.

IV . Методы исследования ультраструктуры

1. Поляризационная микроскопия . В основе метода лежит способность различных компонентов клеток и тканей к преломлению поляризованного света. Некоторые клеточные структуры, например нити веретена деления, миофибриллы, реснички мерцательного эпителия и др., характеризуются определенной ориентацией молекул и обладают свойством двойного лучепреломления. Это так называемые анизотропные структуры .

От обычного биологического микроскопа поляризационный отличается тем, что перед конденсором помещается поляризатор, а за препаратом и объективом помещены компенсатор и анализатор, позволяющие детально исследовать двойное лучепреломление в рассматриваемом объекте. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Поляризационный микроскоп дает возможность определить ориентировку частиц в клетках и других структурах, четко видеть структуры с двойным лучепреломлением, а при соответствующей обработке препаратов можно сделать наблюдения над молекулярной организацией той или иной части клетки.

2. Метод рентгеноструктурного анализа . В основу метода положено свойство рентгеновских лучей испытывать дифракцию при прохождении через кристаллы. Такую же дифракцию они претерпевают, если вместо кристаллов поставить биологические объекты – сухожилие, целлюлозу и другие. На экране или фотопластинке появляется ряд колец, концентрически расположенных пятен и полос. Угол дифракции определяется расстоянием между группами атомов и молекулами в объекте. Чем больше расстояние между структурными единицами, тем меньше угол дифракции, и наоборот. На экране это соответствует расстоянию между темными зонами и центром. Ориентированные частицы дают на диаграмме круги, серпы, точки; неориентированные частицы в аморфных веществах дают изображение концентрических колец.

Метод рентгеноструктурного анализа применяется для изучения строения молекул белков, нуклеиновых кислот и других веществ, входящих в состав цитоплазмы и ядра клеток. Он дает возможность определить пространственное расположение молекул, точно измерить расстояние между ними и изучить внутримолекулярную структуру.

3. Электронная микроскопия . Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания в 1933 г. электронного микроскопа. Основное отличие электронного микроскопа от светового заключается в том, что в нем вместо света используется быстрый поток электронов, а стеклянные линзы заменены электромагнитными полями. Изображение дают электроны, прошедшие через объект и не отклоненные им. В современных электронных микроскопах достигнуто разрешение в 1Ǻ (0,1 нм).

Под электронным микроскопом просматриваются неживые объекты – препараты. Живые объекты изучать пока не удается, т.к. объекты помещаются в вакуум, гибельный для живых организмов. В вакууме электроны, не рассеиваясь, попадают на объект.

Объекты, изучаемые под электронным микроскопом, должны иметь очень малую толщину, не больше 400-500 Ǻ (0,04-0,05 мкм), иначе они оказываются непроницаемыми для электронов. Для этих целей применяют ультрамикротомы , принцип работы которых построен на тепловом расширении стержня, подающего нож к объекту или, наоборот, объект к ножу. В качестве ножей используются специально заточенные мелкие алмазы.

Биологические объекты, особенно вирусы, фаги, нуклеиновые кислоты, тонкие мембраны, обладают слабой способностью рассеивать электроны, т.е. низкой контрастностью. Контрастность их увеличивают путем напыления на объект тяжелых металлов (золото, платина, хром), углеродного напыления, с помощью обработки препаратов осмиевой или вольфрамовой кислотами и некоторыми солями тяжелых металлов.

4. Специальные методы электронной микроскопии биологических объектов. В настоящее время методы электронной микроскопии развиваются и совершенствуются.

Метод замораживания – травления – заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток. В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом получается пленка-слепок, повторяющая прижизненную структуру материала, которую изучают в электронном микроскопе.

Методы высоковольтной микроскопии – сконструированы электронные микроскопы с ускоряющим напряжением 1-3 млн. В. Преимущество этого класса приборов в том, что при высокой энергии электронов, которые меньше поглощаются объектом, можно рассматривать образцы большей толщины (1-10 мкм). Этот метод перспективен и в другом отношении: если при сверхвысокой энергии электронов уменьшается их воздействие с объектом, то в принципе это можно использовать при изучении ультраструктуры живых объектов. Сейчас ведутся работы в этом направлении.

Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии позволяет изучить трехмерную картину поверхности клетки. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), тонкий пучок электронов пробегает по поверхности объекта, отражается от него и попадает в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности.

V . Цито- и гистохимические методы .

Такими методами можно определить содержание и локализацию веществ в клетке с помощью химических реактивов, дающих с выявленным веществом новое вещество специфического цвета. Методы аналогичны методам определения веществ в аналитической химии, но реакция происходит непосредственно на препарате ткани, и именно в том месте, где локализовано искомое вещество.

Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью метода цитофотометрии. Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Было найдено, что интенсивность поглощения лучей пропорционально концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Следовательно, оценивая степень поглощения света данным веществом, можно узнать его количество. Для такого рода исследований используют приборы – микроскопы-цитофотометры; у них за объективом расположен чувствительный фотометр, регистрирующий интенсивность прошедшего через объектив светового потока. Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение поглощения, можно определить как концентрацию данного вещества, так и его абсолютное содержание.

Разработаны приемы количественной флуорометрии, позволяющей по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы. Так, для выявления специфических белков применяют метод иммунофлуоресценции – иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК–ДНК-гибридных молекул.

VI . Фракционирование клеток.

В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные клеточные компоненты и изучать их химию, ультраструктуру и свойства. Так, в настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли ЭПС, рибосомы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, микротрубочки, лизосомы и т.д.

Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время для оседания частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.

Клетка – элементарная единица живого.

Прокариоты и эукариоты

Клетка представляет собой самовоспроизводящуюся систему. В ней имеется цитоплазма и генетический материал в форме ДНК. ДНК регулирует жизнедеятельность клетки и воспроизводит самое себя, благодаря чему образуются новые клетки.

Размеры клеток . Бактерии – диаметр 0,2 мкм. Чаще клетки бывают 10-100 мкм, реже – 1-10 мм. Есть очень крупные: яйцеклетки страусов, пингвинов, гусей – 10-20 см, нервные клетки и млечные сосуды растений – до 1 м и более.

Форма клеток : округлые (клетки печени), овальные (эритроциты земноводных), многогранные (некоторые клетки растений), звездчатые (нейроны, меланофоры), дисковидные (эритроциты человека), веретеновидные (гладкомышечные клетки) и т.д.

Но, несмотря на многообразие форм и размеров, организация клеток всех живых организмов подчинена единым принципам строения: протопласт, состоящий из цитоплазмы и ядра, и плазматическая мембрана. Цитоплазма, в свою очередь, включает в себя гиалоплазму, органоиды (общие органоиды и органоиды специального назначения) и включения.

В зависимости от особенностей строения составных частей все клетки делятся на прокариотические и эукариотические .

Прокариотические клетки характерны для бактерий и сине-зеленых водорослей (цианобактерий). У них нет истинного ядра, ядрышек и хромосом, имеется лишь нуклеоид , лишенный оболочки и состоящий из одной кольцевой молекулы ДНК, связанной с небольшим количеством белка. У прокариот отсутствуют мембранные органеллы – митохондрии, ЭПС, хлоропласты, лизосомы и комплекс Гольджи. Имеются лишь более мелкие, чем у эукариот, рибосомы.

Поверх плазматической мембраны у прокариот имеется жесткая клеточная стенка и, часто, слизистая капсула. Плазматическая мембрана образует впячивания – мезосомы , на мембранах которых располагаются окислительно-восстановительные ферменты, а у фотосинтезирующих прокариот соответствующие пигменты (бактериохлорофилл у бактерий, хлорофилл и фикоцианин – у цианобактерий). Таким образом, эти мембраны выполняют функции митохондрий, хлоропластов и других органелл.

К эукариотам относятся одноклеточные животные (протисты), грибы, растения, животные. У них кроме четко отграниченного двойной мембраной ядра, имеется много других мембранных структур. По количеству мембран органоиды эукариотических клеток можно разделить на три основные группы: одномембранные (ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы), двумембранные (митохондрии, пластиды, ядро), немембранные (рибосомы, клеточный центр). Кроме того, вся цитоплазма разделена внутренними мембранами на реакционные пространства – компартменты (отсеки). В этих отсеках одновременно и независимо друг от друга протекают различные химические реакции.

Сравнительная характеристика различных типов

эукариотических клеток (из Лемеза, Лисов, 1997)

Признаки	Клетки
		протист	грибов	растений	животных
Клеточная стенка Крупная вакуоль Хлоропласты Способ питания Центриоли Резервный питательный углевод	у многих имеется редко бывают часто авто- и гетеротрофное бывают часто крахмал, гликоген, парамил, хризоламинарин	в основном из хитина есть гетеротроф- ное бывают редко гликоген	из целлюлозы есть есть автотрофное только у некоторых мхов и папоротников крахмал	гетеротрофное есть гликоген

Сходство и отличия животных и растительных клеток

Растительные и животные клетки сходны по следующим признакам:

1). Общий план строения клетки – наличие цитоплазматической мембраны, цитоплазмы, ядра.

2). Единый план строения цитоплазматической мембраны, построенной по жидкостно-мозаичному принципу.

3). Общие органоиды – рибосомы, митохондрии, ЭПС, комплекс Гольджи, лизосомы.

4). Общность процессов жизнедеятельности – обмен веществ, размножение, рост, раздражимость и т.д.

В то же время растительные и животные клетки отличаются:

1). По форме: растительные более однообразные, животные – очень разнообразные.

2). По размерам: растительные – более крупные, животные – мелкие.

3). По расположению в тканях: растительные – плотно прилегают друг к другу, животные расположены рыхло.

4). У растительных клеток имеется дополнительная оболочка из целлюлозы.

5). Растительные клетки имеют крупные вакуоли. У животных они если и есть, то маленькие и появляются в процессе старения.

6). Растительные клетки обладают тургором, они упруги. Животные – мягкие.

7). В растительных клетках присутствуют пластиды.

8). Растительные клетки способны к автотрофному питанию, животные – гетеротрофы.

9). У растений нет центриолей (кроме некоторых мхов и папоротников), у животных они есть всегда.

10). Растительные клетки обладают неограниченным ростом.

11). Растительные клетки в качестве запасного питательного вещества накапливают крахмал, животные – гликоген.

12). У животных клеток поверх цитоплазматической мембраны расположен гликокаликс, у растительных его нет.

13). Синтез АТФ в животных клетках происходит в митохондриях, у растительных – в митохондриях и пластидах.

Другие похожие работы, которые могут вас заинтересовать.вшм>
10475.		ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ. ЦИТОПЛАЗМА. ОРГАНЕЛЛЫ И ВКЛЮЧЕНИЯ КЛЕТКИ. СИМПЛАСТЫ И СИНТИЦИИ. СТРУКТУРА ИЗУЧАЕМОГО ПРЕДМЕТА	18.83 KB
	Гук который при помощи сконструированного им примитивного микроскопа увидел в срезе пробкового дерева клетки 1665 год.Пуркинье обнаружил в клетке цитоплазму в 1833 году Броун увидел в клетке ядро в 1838 году Шванн пришел к заключению что клетки различных организмов имеют сходное строение в 1858 году Вирхов установил что новые клетки образуются в результате деления материнской клетки.
2042.		Управление качеством: предмет и задачи курса	18.79 KB
	Говоря о проблеме качества следует отметить что за этим понятием всегда стоит потребитель. Именно с помощью современных методов менеджмента качества передовые зарубежные фирмы добились лидирующих позиций на различных рынках. Российские предприятия пока еще отстают в области применения современных методов менеджмента качества. Между тем повышение качества несет поистине колоссальные возможности.
7774.		Предмет и задачи курса «Охрана труда»	21.72 KB
	В Республике Беларусь РБ по официальным данным ежегодно изза нарушений требований охраны труда на производстве травмируется свыше 5 тысяч работников из них около 250 погибает свыше 800 человек получает тяжелые травмы. На промышленных предприятиях республики и в сельском хозяйстве во вредных условиях труда занято более 30 работающих. Так в РБ изза травматизма на производстве теряется порядка 180 – 200 тысяч человекодней ежегодно страховые выплаты по обязательному страхованию от несчастных случаев на производстве и профзаболеваний...
10725.		Предмет, цели и задачи курса. Теоретические основы изучения и практического использования закономерностей и механизмов возникновения и развития конфликтов, принципов и технологий управления ими в деятельности ОВД	47.97 KB
	Вопросы: Предмет цели и задачи курса Психология конфликта. Теоретикометодологические основы психологии конфликта. Роль и специфика применения знаний психологии конфликта в деятельности органов внутренних дел. Краткое содержание Актуальность данной темы обусловливается не только тем что она вводит в курс нового предмета для изучения – психологии конфликта но и помогает в нем сориентироваться понять что традиции накопления конфликтологических идей имеют многовековую историю.
10977.		Предмет, цель и задачи курса. История развития психологии, ее основные отрасли и методы. Теоретические основы изучения и практического использования психологических закономерностей в правоохранительной деятельности	30.42 KB
	Методологические основы психологии как науки. Существование психологии как самостоятельной научной дисциплины насчитывает менее полтора веков но основная проблематика занимает философскую мысль с тех пор как существует философия. Психология как наука о сознании. Психология как наука о поведении.
6046.		Правовое обеспечение сервисной деятельности в системе правовых дисциплин	22.92 KB
	Источники сервисного права. Среди ученых рассматривающих сервисное право как самостоятельную отрасль права Гущин В. Сервисное право рассматривает следующие ключевые вопросы: сервисное право как наука и как отрасль права; источники сервисного права...
3862.		Предмет, методология и функции курса «История политических учений Запада»	13.32 KB
	В системе юридических наук и юридического образования история политических и правовых учений является отдельной самостоятельной научной и учебной дисциплиной одновременно исторического и теоретического профилей. Эта ее особенность обусловлена тем что в рамках данной юридической дисциплины исследуется и освещается специфический предмет история возникновения и развития теоретических знаний о государстве праве политике и законодательстве история политических и правовых теорий история теорий права и государства. Под соответствующими...
19978.		Содержание правоотношения его место в правовой системе	40.31 KB
	Может отвечать по своим обязательствам вверенным ему имуществом а также от своего имени приобретать и осуществлять имущественные и личные неимущественные права нести обязанности быть истцом и ответчиком в суде; Действует на определенной территории имеет территориальный масштаб деятельности...
10901.		Предмет изучения институциональной экономики и её место в современной экономической теории	32.33 KB
	Основные течения современной этапа развития институциональной экономики как науки. Онтологически институциональная экономика institutionl economy представляет собой особую подсистему экономической системы общества в свою очередь обладающую системными свойствами что позволяет рассматривать ее как институциональную систему хозяйства – целостную совокупность взаимосвязанных и упорядоченных институтов характеризующуюся эмерджентностью и синергическим эффектом. При этом если в качестве точки отсчета выбрать неоклассическую теорию...
9339.		Место и роль государства в политической системе общества	15.23 KB
	Место и роль государства в политической системе общества. Институты политической системы 9. Основой политической системы общества является политическая власть по поводу использования которой формируются и функционируют многообразные государственные и общественнополитические институты нормы и др. Структура политической системы представляет собой многоуровневое образование состоящее из нескольких подсистем.

Цель урока

• познакомиться с известными методами цитологии.

Задачи урока

• выучить основные методы цитологии.

Основные термины

• цитология, световая и электронная микроскопия, метод исследования.

Ход урока

Часть 1. Задачи и методы цитологии. Световая и электронная микроскопия, цито- и гистохимические методы, разделительное центрифугование, рентгеноструктурный анализ.

Наука цитология изучает строение клетки, как основополагающей и функциональной частицы живой материи на планете.Давайте на рисунке 1 вспомним строение клетки и ее форму.

Рис. 1 Клетка – основа живой материи на Земле

Основными задачами этой науки есть следующее:
1) Изучать строение и функционирование клеток;
2) Изучать химический состав клетки и функции клеточных компонентов;
3) Исследовать процесс воспроизведения и размножения клеток;
4) Наблюдать и анализировать, как клетка может приспосабливаться к постоянно меняющимся условиям среды, кторая ее откружает;
5) Исследовать особенности структуры клеток, которые выполняют специализированную функцию;
6) Изучать развитие отдельных клеточных структур, которые выполняют специфическую функцию.
Для решения таких важних и сложных задач в цитологии применяются различные методы. В современное время мы смогли выяснить природу, функции и распределение органелл цитоплазмы после того, как современная биология клетки достигла определенных возможностей в развитии, а именно:
1) метод электронной микроскопии;
2) метод фракционирования клеток. Этот метод помогает биохимикам выделять отдельные фракции клеток, в которых содержатся определенные органеллы. А потом изучать отдельные реакции метаболизма в этих клетках;
3) метод радиоавтографии, который позволяет прямое изучение определенных метаболических реакций в органелах клетки.
Ребята, предлагаю вашому вниманию видео, из котрого вы узнаете, что же изучает наука цитология.

Видео 1 «Жизнь клетки нашого организма»

Давайте их детально изучим и постараемся понять суть и значение каждого метода.
Световая микроскопия является главным методом для изучения клеток. Ребята, предлагаю вам посмотреть следующее видео про микросокопы.

Видео 2 «Устройство светового микроскопа»

Световые микроскопы с использованием солнечного или искусственного света дают нам возможность определить мельчайшие особенности строения отдельной клетки, а также, ее органеллы и оболочку. Дети, на рисунке 2 вы можете увидеть, как выглядит световой микроскоп.


Рис. 2 Световая микроскопия – основной метод в цитологии
Для изучения тонкого строения клеточных структур, кторые не видны человеческому глазу, широко используют электронную микроскопию. В электронном микроскопе самым основной деталью и принципиально важной является пучок электронов.
В цитологи часто используют цито- и гистохимические методы. Они основаны на выборочном воздействии реактивов, красителей для определенных химических веществ цитоплазмы. Эти методы позволяют нам детально изучить химический состав клетки, выяснить местонахождение отдельных химических веществ.
Метод дифференциального или разделительного центрифугирования помогает с помощью центрифуги разделять клетку на отдельные и разные по массе и строению составные части. А потом детально изучать химический состав каждой части.

Рис. 3 Использование рентгена в изучении органов
Рентгеноструктурный анализ позволяет ученым определять расположение в пространстве, а также, физические свойства молекул , которые входят в клеточные структуры. Такой метод позволяет, например, изучить молекулы ДНК и белка. Ребята, на рисунке 3 вы можете частино понять суть этого метода через рентген снимок.

Контролирующий блок №1

1) Что такое цитология?
2) Какие задачи существуют в этой науке?
3) Как человечество решает эти задачи и какие использует для этого методы?

Часть 2. Авторадиография, Метод клеточных культур, Метод микрохирургии, фракцирование, радиоавтография.

Продолжим знакомство и изучение методов цитологии.
Авторадиография – еще один метод, который позволяет обнаруживать места синтеза биополимеров, определять пути и способы переноса питательных веществ в отдельной клетке.


Рис. 4 Деление клетки под микроскопом
Суть этого метода состоит в том, чтобы регистрировать вещества, каждый из которых помечен радиоактивными изотопами. Кино- ифотосъемка помогает ученням фиксировать и в дальнейшем показывать и изучать уже детально отдельные процессы жизнедеятельности клеток. Например, процесс деления клетки. На рисунке 4 давайте вспомним этапы деления клетки.
Метод клеточных культур заключается в выращивании клеток или целых организмов из отдельных клеток с помощью питательных веществ и в условиях погной стерильности. Этот метод дает нам возможность изучать клетки разных органов, тканей растений и животных, а также, деление клетки, их дифференциации и специализации.
Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток, для выяснения функций отдельных органов. Это метод оперативного вмшательства и воздействия на клетку, в т.ч. удаление или вживление отдельных органелл. Этот метод также предусматривает пересадку органелл из клетки в клетку, введение крупних макромолекул в клетку. На рисунке 5 вам будет понятна суть метода микрохирургии.


Рис. 5 Микрохиругия
Фракцирование помогает выделять органеллы из отдельных клеток. Этот метод широко используется и имеет саме важные и главные результаты.
Он помогает определять химический состав органелл и
ферменты, которые в них находятся. Результаты этого метода позволяют понищать суть и значение их функций в клетке.
Сначала клетки доводят до разрушения с помощью гомогенизации и в определенной бреде. Эта середа гарантирует сохранность органелл и препятсвует их агрегации. Мембранные переплетения, эндоплазматический ретикулум и плазматическая мембрана распадаются на фрагменты и позволяют ученням тщательно изучать их строение и функции.
Дети, на рисунке 6 вы можете видеть фракционную частицу клетки, кторая получена данным методом.
]]
Рис. 6 Выделение фракцій клетки под микроскопом
Еще один относительно новый метод помог человечеству безгранично расширить свои возможности в световой и электронной микроскопии.
Данный метод получил название радиоавтография. Это самый современный метод, возникший после стремительного развития ядерной физики, в результате которого мы смогли выделить радиоактивные изотопы разных элементов.
С помощью рисунка 7, ребята, давайте разберемся, что такое изотоп.


Рис. 7 Что такое изотопы?
Для этого метода нужны изотопы тех элементов, которые используются клеткой или могут связываться с веществами, используемыми клеткой, и которые можно вводить животным или добавлять к культурам в количествах, не нарушающих нормального клеточного метаболизма.
Ребята, в следующем видео вы поймете, что такое нанотехнологии и их роль в цитологи.

Видео 3 «Нанотехнологии»

Поскольку радиоактивный изотоп (или помеченное им вещество)
участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог, и в то же время испускает излучение, путь изотопов в организме можно проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. Дети, на рисунке 8 показан радиоактивный изотоп со свои излучением.

Рис. 8 Радиоактивный изотоп
Один из способов обнаружения радиоактивности основан на ее способности действовать на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучение проникает сквозь черную бумагу, используемую для того, чтобы защитить фотопленку от света, и оказывает на пленку такое же действие, как свет.

Контролирующий блок №2

1) Назовите основной метод в цитологии. Насколько важны результаты этого метода в изучении клетки и ее органелл?
2) Какой вы знаете последний и самый новый метод в цитологии?

Задание.

Составить сравнительную таблицу, в которой провести анализ всех изсвестных методов в цитологи.

Список использованной литературы.

1) Урок на тему «Наука цитология и ее задачи» Мошурова А. Р., учителя биологии, г. Кировоград, сш № 7.
2) Урок на тему «Световая и электронная микроскопия» Пузырь М. С., учителя биологии, г. Днепропетровск, сш №2.
3) Урок на тему «Изучение клетки и достижения человечества» Кротова В.А., г. Кривой Рог, школа №3.
4) Пехов А. П. Биология с основами экологии. Серия «Учебники для вузов. Специальная литература» - 2008.
5) Горелов А. А. Концепции современного естествознания. – М.: Мысль, 2008.
6) Н.А. Лемеза, Л.В.Камлюк, Н.Д. Лисов "Пособие по биологии для поступающих в ВУЗы" – 2009.

Отредактировано и отправлено Чепец Т.П.

Над уроком работали:

Мошурова А.Р.

Пузырь М.С.

Кротова В.А.

Чепец Т.П.
Запорожец А.

Поставить вопрос о современном образовании, выразить идею или решить назревшую проблему Вы можете на Образовательном форуме , где на международном уровне собирается образовательный совет свежей мысли и действия. Создав блог, Вы не только повысите свой статус, как компетентного преподавателя, а и сделаете весомый вклад в развитие школы будущего. Гильдия Лидеров Образования открывает двери для специалистов высшего ранга и приглашает к сотрудничеству в направлении создания лучших в мире школ.

Предмети > Биология > Биология 10 класс